Uma abordagem de engenharia do sistema de transporte de Saccharomyces cerevisiae para expandir o repertório de absorção de açúcar de uma cepa industrial empregando as tecnologias CRISPR/Cas e evolução direta.

Resumo

No processo de produção de etanol de segunda geração (etanol 2G), a hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica libera uma mistura de açúcares, incluindo hexoses (por exemplo, glicose), pentoses (por exemplo, xilose) e celodextrinas (por exemplo, celobiose). Durante a etapa de fermentação, o transporte desses açúcares para o interior da célula da levedura é a primeira e crítica etapa para permitir a produção microbiana de etanol. Uma das principais limitações desse processo é que Saccharomyces cerevisiae carece de um sistema de transporte de açúcar (STS) eficiente, capaz de internalizar outros açúcares citados acima, além da glicose, e não é capaz de metabolizá-los. Para superar esses gargalos, esta proposta visa desenvolver leveduras capazes de internalizar e co-fermentar xilose e celobiose de forma eficiente. Como a maioria dos transportadores de açúcar nativos derivados de diferentes microrganismos apresentam uma ampla variedade de substratos e / ou baixa atividade, será empregada uma abordagem de evolução direta para obtenção de transportadores de xilose (GXF1 de Candida intermedia e Cs4130 de Candida sojae) e transportadores de celobiose (Tr69957 de Trichoderma reesei e CDT-2 de Neurospora crassa), com especificidade e atividade otimizadas frente a esses açúcares. Em seguida, o sistema CRISPR/cas9 será empregado para realizar modificações genéticas na cepa industrial S. cerevisiae Pedra-2 (PE-2), incluindo as vias metabólicas de xilose e celobiose, juntamente com os transportadores de açúcar mutados. Posteriormente, uma biblioteca baseada em plasmídeo acoplada a um sistema de modulação baseado em CRISPR-dCas9 será aplicado para selecionar novos genes alvo visando beneficiar a co-fermentação de celobiose/xilose por S. cerevisiae. Por fim, será analisado o desempenho fermentativo da cepa resultante. Ao final deste trabalho, será obtida uma cepa PE-2 modificada capaz de co-fermentar celobiose e xilose de maneira eficiente, evidenciando a engenharia do STS como uma estratégia crucial para o aprimoramento de cepas industriais. (AU)