Aplicação de bibliotecas CRISPR para o screening de fatores celulares associados à neuroinfecção por arbovírus

Resumo

As arboviroses representam um grave problema de saúde pública o qual tem se agravado nos últimos anos devido à inserção de novos vírus em populações altamente susceptíveis. A circulação concomitante de diferentes vírus resulta em uma carga elevada aos sistemas de saúde, o qual encontra-se despreparado para lidar com as diferentes formas clínicas destas infecções. Sabe-se que a infecção por arbovírus geralmente resulta em um quadro febril agudo, no entanto uma parcela significativa das infecções cursa para o desenvolvimento de quadros neurológicos graves. Neste contexto, os mecanismos moleculares que participam no controle da infecção versus evolução das diferentes formas clínicas permanecem desconhecidos. A presente proposta visa avaliar a aplicabilidade de uma biblioteca CRISPR-Cas9 como ferramenta para a identificação de fatores críticos para a infecção e dano celular ocasionado por diferentes arbovírus de interesse. Essa biblioteca consiste no agrupamento de 77.441 guias direcionadas para a deleção de aproximadamente 19 mil genes humanos. Desta maneira, poderemos realizar um rastreio (screening) global do genoma humano para fatores relacionados à resposta do hospedeiro frente à infecção experimental por arbovírus, por meio da deleção gênica mediada por CRISPR/Cas9 em células permissivas. Após a construção de clones celulares expressando a enzima Cas9 constitutivamente e transdução da biblioteca por lentivirus, submeteremos as populações de células knockout à infecção letal com isolados dos vírus Zika, Chikungunya e Mayaro. Por fim, iremos determinar genes e vias envolvidos na replicação e dano celular através do sequenciamento das células sobreviventes e identificação das guias presentes naquela população. Os genes identificados serão ranqueados e agrupados de acordo com a via ou processo celular o qual participam através de ferramentas de anotação gênica (Gene Ontology). Ensaios funcionais para os genes identificados serão posteriormente realizados, podendo incluir, mas não limitados a: i) ensaios de avaliação da carga viral para genes codificantes de receptores e/ou proteínas de superfície ii) ensaios de avaliação da morte celular para genes envolvidos na sinalização para apoptose ou outras formas de morte celular iii) perfil de citocinas e quimiocinas inflamatórias para genes envolvidos na ativação da inflamação. Desta maneira, a presente proposta poderá contribuir na identificação de vias moleculares envolvidas na infecção por arbovírus, podendo acrescentar novos conhecimentos acerca dos processos da interação vírus-hospedeiro, os quais por sua vez podem levar à descoberta de potenciais novos alvos terapêuticos. (AU)