Altos níveis de renaturação de nucleocapsídeo de SARS-CoV-2 usando uma condição branda de solubilização dos corpos de inclusão: aplicação de alta pressão em pH 9.0

• Processo: 22/00051-3
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2022
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2022
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias
• Beneficiário: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias
• Instituição Sede: Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). Secretaria de Desenvolvimento Econômico (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): SARS-CoV-2
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: High pressure | Inclusion bodies | Mild solubilization | Nucleocapsid | refolding | SARS-CoV-2 | Produção de Proteínas recombinantes

Resumo

A Nucleocapsídeo (N) de SARS-CoV-2 é a mais abundante proteína viral expressa em amostras dos hospedeiros e é um antígeno importante para diagnóstico. N é uma proteína com 45 kDa que não apresenta pontes disulfeto. Com o objetico de evitar ligações não específicas de N de SARS-CoV2 a anticorpos de pacientes que haviam previamente tido diferentes coronaviroses, um fragmento de 35 kDa de N foi expresso sem um motivo conservado em E. coli como corpos de inclusão (N122-419-IB). O meio de cultura e as lavags dos IB foram escolhidas para obter N122-419-IB com alto rendimento (370 m/L cultura bacteriana) e pureza (90). Alta pressão solubiliza agregados proteicos por enfraquecer interções hidrofóbicas e iônicas e o pH alcalino promove solubilização por repulsão eletrostática. A associação de pH 9.0 e 2,4 kbar promove a eficiente solubilização de N122-419-IB sem perda de estrutura terciária semelhante a nativa que a N apresenta nos IBs. N122-419 foi renaturada com um rendimento de 85 (326 mg/L cultura e 95 por cento de pureza. O processo de renaturação leva somente duas horas e a proteína está pronta para uso após o ajuste de pH, evitando a necessidade de diálise ou purificação. A ligação de anticorpos em soros de pacientes positivos para COVID-19 para N122-419 foi confirmada por Western blotting. O ELISA usando N122-419 é eficaz na distinção entre soros que apresentam anticorpos contra SARS-CoV-2 daqueles que não apresentam. Até onde sabemos, a condição proposta para a solubilização do IB é uma das mais brandas descritas. É possível que o processo de renaturação possa ser estendido a uma ampla gama de proteínas com alto rendimento e pureza, mesmo aquelas que são sensíveis a pH muito alcalino. (AU)