PCR multiplex em tempo real usando SYBR Green: corante intercalante inespecífico para detectar genes de resistência antimicrobiana de Streptococcus pneumoniae no líquido cefalorraquidiano

• Processo: 22/06812-6
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2022
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2023
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Saúde Coletiva - Saúde Pública
• Pesquisador responsável: Ivana Barros de Campos
• Beneficiário: Ivana Barros de Campos
• Instituição Sede: Instituto Adolfo Lutz (IAL). Coordenadoria de Controle de Doenças (CCD). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Streptococcus pneumoniae SYBR Green Vigilância em saúde pública
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: cerebrospinal fluid | melting temperature | multiplex qPCR | resistance genes | Streptococcus pneumoniae | SYBR green | Vigilância em Saúde Pública

Resumo

A meningite causada por Streptococcus pneumoniae ainda é uma doença de grande impacto na Saúde Pública, que requer diagnóstico e tratamento imediatos. No entanto, a cultura de amostras clínicas é muitas vezes negativa e o teste de suscetibilidade a antibióticos (AST) deve ser realizado com cepas isoladas. A reação em cadeia da polimerase em tempo real multiplex (qPCR) tem alta sensibilidade e especificidade, produz resultados mais rápidos para identificar o patógeno e também pode ser uma ferramenta importante para identificar genes de resistência a antibióticos mais cedo que AST, especialmente na ausência de cepa isolada. Este estudo desenvolveu um ensaio de qPCR multiplex, usando SYBR Green como um corante inespecífico, para detectar genes de resistência a antibióticos para prever suscetibilidade/resistência pneumocócica em amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com meningite. De 2017 a 2020, amostras de LCR foram cultivadas e analisadas por qPCR para detectar as três principais bactérias causadoras de meningite. As cepas isoladas e de referência foram aplicadas no multiplex SYBR Green qPCR para detectar os genes pbp2b, ermB e mef, e os resultados foram comparados com o AST. Amostras de LCR positivas para pneumococo (gene lytA positivo) sem cepas isoladas também foram testadas para avaliar o perfil de suscetibilidade antimicrobiana na região de 2014 a 2020. Foram recebidas 873 amostras de LCR; 263 foram cultivados, 149 foram lytA-positivas na qPCR e 25 obtivemos cepas de pneumococos isoladas viáveis, que foram avaliadas por AST, além de 26 cepas de pneumococo de referência. A temperatura de melting de cada gene e os critérios de aceitação foram determinados (pbp2b: 78,24-79,86; ermB: 80,88-82,56; mef: 74,85-76,34 ºC). Um total de 48/51 cepas apresentou um perfil genético de acordo com os resultados da AST. As cepas resistentes à eritromicina e clindamicina foram ermB-positivas, e duas também foram mef-positivas, indicando que ambos os mecanismos de resistência estavam presentes. No estudo retrospectivo do perfil genético de resistência, 82 amostras de LCR lytA-positivas mais 4 cepas foram aplicadas no multiplex SYBR Green qPCR: 51% das amostras apresentaram o genótipo selvagem (pbp2b positivo e ermB/mef negativo); 15% foram negativas para os três avaliados, indicando pneumococos resistentes à penicilina; e 17% representaram os pneumococos multirresistentes (pbp2b negativo e ermB positivo ou pbp2b negativo e ermB e mef positivo). Portanto, SYBR Green qPCR multiplex provou ser uma ferramenta confiável para identificar genes de resistência em S. pneumoniae e seria mais barato do que multiplex qPCR usando sondas específicas. Isso poderia ser facilmente introduzido na rotina dos laboratórios de diagnóstico e fornecer uma forte presunção de resistência pneumocócica, especialmente na ausência de cepas isoladas. (AU)