Complexo de processamento do tRNA mitocondrial

• Processo: 23/02534-4
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Pesquisador Visitante - Internacional
• Data de Início da vigência: 05 de setembro de 2023
• Data de Término da vigência: 20 de novembro de 2023
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
• Pesquisador responsável: Mario Henrique de Barros
• Beneficiário: Mario Henrique de Barros
• Pesquisador visitante: Carol Louise Dieckmann
• Instituição do Pesquisador Visitante: University of Arizona , Estados Unidos
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Município da Instituição Sede: São Paulo
• Assunto(s): Mitocôndrias Saccharomyces cerevisiae Tradução Biogênese de organelas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: mitocôndria | RNaseP | Saccharomyces cerevisiae | Tradução | Biogênese mitocondrial

Resumo

As mitocôndrias são essenciais para a vida; são compartimentos subcelulares críticos que geram a energia que impulsiona a maioria das reações celulares. Usamos levedura para estudar a genética e a bioquímica da função mitocondrial. A levedura, como todos os eucariotos, tem um genoma mitocondrial de 80.000 pares de bases, além de 12 milhões de pares de bases em cromossomos nucleares. A transcrição do genoma mitocondrial produz RNAs precursores multigênicos que devem ser processados antes de funcionarem como mRNAs, rRNAs e tRNAs. Propomos focar a pesquisa nesta proposta na enzima RNase P mitocondrial de levedura, que cliva tRNAs precursores para produzir extremidades 5' maduras. O laboratório da Dr. Dieckmann mostrou que o componente proteíco Rpm2 da RNase P está ligado a um ácido graxo, uma modificação covalente necessária para a sua atividade. O laboratório do Dr. Barros mostrou que Rpm2 reside em um complexo de várias proteínas adicionais também necessárias para o processamento de 5' tRNA e que o complexo está associado à membrana mitocondrial interna. Nossa hipótese atual é que a modificação de ácido graxo de Rpm2 permite a ancoragem da enzima na membrana mitocondrial interna e/ou montagem com outras proteínas necessárias para a função ideal da RNase P de alguma forma que ainda não entendemos. O objetivo da pesquisa é determinar se a modificação de ácido graxo de Rpm2 é necessária para a associação de membrana RNase P e/ou formação de um complexo com outras proteínas, e o efeito na atividade de RNase P em mitocôndrias de levedura.Objetivo 1: Individualizar mutações do mutante Rpm2 sensível à temperatura (ts). O Dr. Barros fez coleções de mutações ts nos genes que codificam cinco proteínas necessárias para o processamento do tRNA. Em uma cepa ts, há três mutações no gene para Rpm2. Faremos três linhagens com cada mutação individual e uma linhagem dupla mutante com duas mutações próximas. Todas as mutações serão feitas por mutagênese dirigida ao local e o gene será reintroduzido em uma cepa sem Rpm2 do tipo selvagem. Objetivo 2: Analisar o efeito das mutações no crescimento respiratório e na modificação dos ácidos graxos do Rpm2. O crescimento de colônias de leveduras será avaliado em placas que requerem respiração. A modificação de ácido graxo de Rpm2 será avaliada por gel shift assay de Rpm2 marcado com CH imunoblotted. Objetivo 3: Determinar se as mutações ts perturbam a formação do grande complexo de todas as sete proteínas, afetam a interação de Rpm2 e Mta1 especificamente e/ou afetam a associação com a membrana. Os efeitos das mutações no grande complexo podem ser avaliados por eletroforese em gel nativo azul seguida de imunotransferência com anti-soro anti-marcador (diferentes marcadores em Rpm2 e Mta1). A interação de Rpm2 e Mta1 será avaliada por pull downs com anti-tag de extratos de uma cepa marcada em Rpm2, seguido de imunoblotting com o respectivo anti-soro. Avaliações recíprocas serão feitas começando com Mta1 pulldowns. A associação da membrana será avaliada por uma combinação de centrifugação diferencial e extração de sal e/ou detergente. Objetivo 4: Determinar se o nocaute da síntese de ácidos graxos mitocondriais (mutação KO do gene que codifica Etr1, que codifica uma enzima na via biossintética) afeta a formação de grandes complexos, interação Rpm2-Mta1 e/ou associação de membrana. Significado: Nosso trabalho aprofundará o conhecimento do complexo enzimático de processamento de tRNA 5' de várias subunidades e o requisito crucial para a modificação covalente de ácidos graxos de Rpm2. Isso pode vir a ser um modelo para a regulação de outros conjuntos de proteínas mitocondriais. (AU)