Decifrando a função de RNAs não codificadores de Leishmania na interface parasita-hospedeiro

• Processo: 24/16197-2
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Temático
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2025
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2028
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Angela Kaysel Cruz
• Beneficiário: Angela Kaysel Cruz
• Pesquisador Responsável no exterior: Jeremy Mottram
• Instituição Parceira no exterior: University of York, Inglaterra
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Pesquisadores principais: ANA PAULA CABRAL DE ARAUJO LIMA ; Pegine Walrad
• Pesquisadores associados: Daniel Jeffares ; Michael John Plevin
• Assunto(s): Genética reversa
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: genome-wide reverse genetics screen | ncRNA | reverse genetics | RNA binding proteins | Molecular Genetics of parasites

Resumo

Mais de 1 bilhão de pessoas correm risco de infecção pelo protozoário parasito Leishmania, transmitido por inseto vetor. Na América do Sul e C entral, espécies de Leishmania no subgênero Viannia, como L. braziliensis, causam leishmaniose cutânea e mucocutânea. Ao contrário de muitas outras Doenças Tropicais Negligenciadas que tiveram grande sucesso recente em medidas de redução, incluindo malária e Doença do Sono, a incidência de leishmaniose está aumentando globalmente. Um objetivo central à pesquisa do parasito Leishmania é entender como ele transita por seu complexo ciclo de vida, se adapta ao seu ambiente e desabilita nossas defesas imunológicas. Entender esses mecanismos em um nível molecular nos permitirá desenvolver novas terapias e vacinas. Até o momento, a maioria dos estudos genéticos de Leishmania se concentrou no papel dos genes codificadores de proteínas na progressão do ciclo de vida. Nossa pesquisa mostrou que vários RNAs não codificadores de proteínas (ncRNAs), conhecidos por desempenhar papéis centrais em processos metastáticos de câncer e outras condições fisiológicas e patológicas em humanos, também desempenham papéis cruciais na sobrevivência e infectividade de L. braziliensis. Nossa hipótese é que o genoma de Leishmania codifica muitos outros ncRNAs não caracterizados que atuam como reguladores-chave da virulência, metástase e potencial de doença do parasita.Para testar essa hipótese no objetivo 1, tentaremos nocautear 650 ncRNAs putativos já identificados em L. braziliensis, que são preferencialmente, ou altamente, expressos em amastigotas, o estágio proliferativo causador da doença que se multiplica intracelularmente no hospedeiro humano. Cada mutante nulo carregará um código de barras genético exclusivo, e os mutantes organizados em grupos (pools) passarão por fenotipagem do ciclo de vida em cultura in vitro, em macrófagos e em camundongos. Ao sequenciar os códigos de barras na população (bar-seq), determinaremos quais ncRNAs são necessários em cada estágio do ciclo de vida. Importante, faremos todos os experimentos in vivo com um modelo de infecção em camundongo recentemente desenvolvido, que dá lesões no dorso do camundongo que são semelhantes às lesões cutâneas humanas.No objetivo 2, selecionaremos ncRNAs em que parasitos nocaute exibem perda de aptidão (Loss of function - LOF) em comparação com parasitas selvagens em infecções de macrófagos ou camundongos. Usaremos 10 a 20 desses ncRNAs principais para investigação mecanística detalhada. Confirmaremos que a perda de aptidão deve-se especificamente à exclusão do ncRNA e não a efeitos colaterais, reintroduzindo a expressão do ncRNA usando parasitos em que o gene é reintroduzido (add-back) ou superexpresso. As linhagens serão testadas, e comparadas por métodos de sequenciamento de RNA e RT-qPCR. Identificaremos os parceiros proteicos desses ncRNAs, o que facilitará nossa compreensão das vias e redes de proteínas e RNAs envolvidos em aspectos-chave do desenvolvimento do parasita e da infecção de mamíferos. Para esta análise, empregaremos dois sistemas in vitro diferentes e desenvolveremos e compararemos ensaios de pulldown in vivo. No objetivo 3, marcaremos ncRNAs regulatórios (por fluorescência ou etiquetas com afinidade a streptavidina) associando proteínas para visualizar interações e tráfego intracelular in vivo e imunoprecipitar algumas das proteínas ligantes destes ncRNAs para confirmar essas interações. Entre os ncRNAs cujos nocautes resultam em infecção prejudicada, 5-10 serão analisados in vivo em camundongos usando imagens in vivo de L. braziliensis bioluminescentes e IVIS longitudinal (microscopia intravital). O objetivo geral é alavancar abordagens de última geração para acelerar a compreensão e descoberta de ncRNAs como alvos moleculares para novas terapias contra leishmaniose, conforme já demonstrado para outras doenças. (AU)