Caracterizacao de celulas da granulosa e de fibroblastos fetal e adulto de bovinos da raca nelore como fonte doadora de nucleos na reconstrucao de embrioes.

• Processo: 01/11931-8
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2002
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2005
• Área do conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
• Pesquisador responsável: José Antonio Visintin
• Beneficiário: José Antonio Visintin
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Gado Nelore Embrião Transferência nuclear Fibroblastos Telômero
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Embrioes | Fibroblastos | Granulosa | Nelore | Telomero | Transferencia Nuclear

Resumo

O objetivo deste estudo será caracterizar as células da granulosa e os fibroblastos fetal e adulto de bovinos da raça Nelore como fontes doadoras de núcleos na reconstrução de embriões. Para tanto, serão utilizados células da granulosa de folículos aspirados por ultra-som e fibroblastos colhidos por biópsia auricular de animais adultos ou implantes de f. fetos de 60 dias oriundos de matadouro. As células da granulosa e os fibroblastos serão caracterizados por aspectos morfológicos e imunocitoquímicos (Experimento I). Para a reconstrução dos embriões serão utilizados oócitos de ovários colhidos em matadouro, maturados in vitro por 16 horas e enudeados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafísica. As células da granulosa ou os fibroblastos serão inseridos sob as zonas pelúcidas dos oócitos enucleados e os complexos citoplasma receptor-núcleo doador (CCN) eletrofundidos com 2 pulsos de 4,5Kv/cm durante 20μs. Após a eletrofusâo, os embriões reconstruídos serão ativados por 1 hora em TCM 199 contendo 10% de soro fetal bovino, 10μg de ciclohexemide por ml e 2,5μg de citocalasina D por ml em estufa a 39°C, 5% de CO2 e alta umidade, sendo em seguida mantidos por mais 4 horas em TCM 199 contendo 10% de soro fetal bovino e 10μg de ciclohexemide por ml. Os embriões reconstruídos e ativados (Experimentos II), assim como os não manipulados (Controle), serão co-cultivados em células da granulosa bovina no meio TCM 199 por 9 dias em estufa a 39°C, 5% de CO2 e alta umidade, para avaliar o desenvolvimento embrionário. Os embriões que alcançarem o estádio de blastocisto serão transferidos para receptoras sincronizadas, sendo o diagnóstico de prenhez realizado por ultra-som aos 30 dias de gestação. As células da granulosa, os “fibroblastos adulto e fetal, os embriões e os possíveis bezerros serão avaliados quanto ao comprimento do telômero e a atividade da telomerase. Unitermos: células da granulosa, fibroblastos, transferência nuclear, telômero, embriões bovinos. (AU)