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Efeito da carga da região amino terminal sobre a conformação, interação com membrana e atividade biológica da esticolisina II, uma citolisina formadora de poros

Processo: 06/00091-2
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de junho de 2006 - 31 de março de 2009
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Reinaldo Marchetto
Beneficiário:Reinaldo Marchetto
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
Assunto(s):Bioatividade  Síntese  Estrutura  Peptídeos  Membrana 

Resumo

O nosso grupo de pesquisa têm desenvolvido nos últimos anos estudos envolvendo a relação estrutura/função de peptídeos e proteínas. Estes estudos têm permitido relacionar, em alguns casos, as propriedades conformacionais com a atividade biológica envolvida. Neste tipo de estudo, a membrana também pode ser um alvo importante, principalmente por ser a superfície mais externa da célula. Nos estudos envolvendo a interação da membrana com macromoléculas são utilizados miméticos constituídos por detergentes e lipídeos com propriedades básicas, ácidas ou neutras, além da presença de lipídeos com propriedades especiais como colesterol, esfingomielinas e outros. Neste sentido, nosso grupo tem estudado até o momento a região N-terminal da St II. Os resultados obtidos até agora mostram que um peptídeo contendo os 30 primeiros aminoácidos, apresenta atividade hemolítica, embora muito menor que a da proteína original. Apesar desta baixa atividade, o fato deste peptídeo apresentar atividade funcional e formar poros na membrana semelhantes à proteína completa, permite através do seu estudo analisar em maiores detalhes o modo de ação da St II, visto que a região responsável pela formação de poros é a N-terminal. Tendo em vista que as citolisinas St I e St II, possuem atividades diferentes e que as principais alterações que diferenciam estas proteínas estão na região amino-terminal (primeiros 30 resíduos), este trabalho terá como um dos objetivos comparar os fragmentos amino-terminais destes dois polipeptídios buscando compreender as suas diferenças funcionais e relacioná-las com as proteínas completas. Para o desenvolvimento deste tópico serão sintetizados peptídeos carboxiamidas (mimetizando melhor a ligação peptídica existente na ponta carboxi terminal) correspondentes às regiões N-terminais da St I e da St II, incluindo alguns de seus análogos. Os estudos destes peptídeos permitirão avaliar quais das modificações são mais importantes para explicar a diferença de atividade entre a St II e a St I. Outro objetivo deste trabalho será o de avaliar a importância da polaridade da extremidade amino-terminal destas proteínas. Para isto, diferentes seqüências, contendo os 30 primeiros resíduos da região amino-terminal da St II serão sintetizados alterando-se a carga de sua extremidade N-terminal. Este estudo é importante não só pelo fato de que uma das principais diferenças entre a St I e a St II é a inclusão de uma serina em sua extremidade, mas também pelo fato de que uma variante recombinante da St II contendo resíduos de histidina em sua extremidade não apresenta a mesma capacidade de formar poros que a proteína original, apesar de apresentar maior ligação com pequenas vesículas unilamelares. Os peptídeos que serão sintetizados neste bloco são os contendo os 30 primeiros resíduos da St II mais a Ser (semelhante a St I), Asp (cadeia lateral negativa), Lys (cadeia lateral positiva)ou o grupo acetil em sua extremidade amino-terminal (anulando a carga positiva da extremidade amino-terminal). Adicionalmente, na posição 2 desta seqüência um resíduo de leucina será substituído por triptofano (fluorescente). Esta modificação será realizada para permitir o uso da técnica da fluorescência nos estudos de interação destes peptídeos com miméticos de membrana - micelas e lipossomas. Este tipo de abordagem é uma das estratégias mais bem sucedidas e viáveis neste tipo de análise. Ressaltamos, que o fragmento de STII contendo o triptofano na posição 2 já foi sintetizado em um projeto anterior mantendo a atividade do fragmento original.Esperamos com estes estudos obter maiores informações sob o modo de ação destas proteínas bem como entender as diferenças de atividades entre as diferentes esticolisinas. (AU)