Levantamento e avaliacao de sazonalidade de virus entomopatogenicos em larvas de culicideos no estado de sao paulo.

• Processo: 06/00868-7
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2006
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2008
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Entomologia e Malacologia de Parasitos e Vetores
• Pesquisador responsável: Carlos José Pereira da Cunha de Araújo Coutinho
• Beneficiário: Carlos José Pereira da Cunha de Araújo Coutinho
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Controle biológico
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Controle Biologico | Culicideos | Virus Entomopatogenicos | Patologia de Dípteros Vetores

Resumo

O controle microbiano de insetos vetores apresenta vantagens sobre ao químico devido à especificidade ao hospedeiro e a habilidade para reciclar. Até o momento, os únicos agentes microbianos que obtiveram êxito na alteração do desenvolvimento de larvas de mosquitos foram o Bacillus thuringiensis var. israelensis e B. sphaericus., porém com o rápido aparecimento de resistência para B. sphaericus novos agentes microbianos estão sendo investigados. Um outro grupo de agentes microbianos que afetam mosquitos são os baculovirus Eles infectam naturalmente somente artrópodes e são inofensivos para outros invertebrados não-alvo e vertebrados. Recentemente foi caracterizado molecularmente o CuniNPV, um baculovírus altamente patogenico para Culex nigripalpus e Cx. quinquefaciatus, insetos vetores de encefalites de impacto em populações humanas. Este vírus, infecta e lisa o intestino médio das larvas, causando infecções dentro de 48 e morte 72 - 96 horas pós-inoculação. O CuniNPV é portanto um agente biológico potencial para o controle de populações naturais de insetos culicídeos. Devido a alta freqüência e abundancia de espécies de culicideos em ambientes urbanos e peri-urbanos no estado de São Paulo, a infecção destes mosquitos por CuniNPV precisa ser verificada. Para tanto, larvas de mosquitos serão coletadas quinzenalmente durante 24 meses no Parque Estadual do Tiete e na encosta da Serra do Mar. No laboratório, as larvas passarão por um processo de filtragem em redes de malhas de 0,25, 0,50, 1,0 e 2,0 mm para separá-las em tamanhos similares e remover grandes predadores. As larvas de 3o e 4o estádios (retidas em malha de 1,0 mm) serão examinadas tanto na parte ventral quanto dorsal em busca de sinais de infecção. Com o objetivo de determinar a dinâmica epizootica e endozootica será estimada a prevalência da infecção viral, em larvas de mosquitos coletados mensalmente nos sítios de coleta. Técnica padrão de bioensaio possibilitará avaliação do potencial inseticida e patogenicidade do material estocado. Serão separados dois grupos de 20 larvas de 3o estádio em copos plásticos de 300 ml de água destilada e sem alimentação. Um grupo será exposto a 1 ml da suspensão estocada e o outro a 1ml de água deiozonizada (grupo controle). As larvas serão examinadas diariamente a partir de segundo dia de exposição por um período de 6 dias. A partir de larvas positivas para a infeccao, serão purificados os corpos de oclusão por ultracentrifugação. Primeiro as larvas infectadas serão grosseiramente filtradas em tela de poliéster para eliminação de porções maiores de tecido. O filtrado será centrifugado por 5 min, e o sobrenadante será filtrado usando filtro hidrofóbico de 0,45 µm. O filtrado será purificado por centrifugação em ultracentrifuga usando como meio Ludox 30%. O pellet resultante será suspenso por duas vezes em NaOH 0,1 mM, pH 10,0, depois lavado duas vezes em água deionizada. A preparação resultante será estocada em freezer a 4 ºC.A suspensão com os corpos de oclusão será incubada por 5 min. O pH será corrigido para 12,0 com 0,1 M de NaOH. Acrescentar 1/10 vol. de Tris-HCl 1 M. Para digestão das proteínas será utilizada Proteinase K (em SDS 1%) e 200 mM de β-mercaptoetanol a 56 ºC overnight. Após extração, o DNA viral será amplificado através da reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir de primers especificos para CuniNPV. Os segmentos amplificados serão submetidos a sequenciamento. Os resultados serão comparados a seqüências de CuniNPV depositadas no GeneBank, para verificarmos a homologia das seqüências obtidas e determinarmos a identidade genética do material. (AU)