Viabilizando o sequenciamento de DNA em diferentes sistemas biológicos

• Processo: 09/08210-9
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2010
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2012
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular
• Pesquisador responsável: Estela Maris Andrade Forell Bevilacqua
• Beneficiário: Estela Maris Andrade Forell Bevilacqua
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Biologia celular Análise de sequência de DNA NADPH oxidase Apoptose Transcrição genética Insetos Larva Biblioteca gênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: biologia celular | Controle de praga agrícola | desenvolvimento de insetos | metamorfose | NADH oxidase | Sequenciamento de DNA | Biologia Celular

Resumo

Visando uma estratégia solidária este projeto reúne três grupos de pesquisa trabalhando em diferentes modelos biológicos para viabilizar procedimentos de seqüenciamento de DNA. Esta medida visa: facilitar a interação entre nossos grupos, possibilitando a cooperação ativa e a construção de novas idéias integradoras futuras; favorece a exploração de novas possibilidades de trabalho o que aumenta a possível abrangência de nossos resultados; propõe atividades técnicas conjuntas entre nossos estudantes e técnicos, otimizando assim conhecimento e praticidade de execução de tarefas, além da óbvia redução de custos e amplia o repertório de experiências, estimulando o amadurecimento e o desenvolvimento global dos integrantes dos grupos ao mesmo tempo em que reduz o tempo de independência e de aquisição de habilidades ferramentais. Neste contexto e utilizando principalmente o seqüenciamento de DNA, este projeto pretende: 1. Clonar e caracterizar o cDNA das subunidades gp91, p22phox, p40phox, p67phox e p47phox da NAD(P)H oxidase das células trofoblásticas de camundongo durante a fase de implantação embrionária e analisar comparativamente as sequências obtidas com as seqüência da NADPH-oxidase fagocítica, envolvida com processos de defesa orgânica, o que poderá ser de extrema valia na compreensão dos mecanismos específicos associados à barreira placentária e na defesa do embrião-feto (subprojeto 1); 2. Caracterizar mensagens associadas ao processo de metamorfose larval de Rhynchosciara americana enfocando principalmente o processo de morte celular programada que ocorre na glândula salivar deste díptero. Este procedimento incluirá a construção de uma biblioteca subtrativa de cDNAs de glândulas salivares de larvas em desenvolvimento (2º período e pré-pupas), seu conseqüente seqüenciamento e caracterização. Os genes de interesse terão seus perfis de expressão determinados e quantificados por Real Time PCR nas células do corpo gorduroso, órgão que durante a metamorfose sobre modificação na forma e funções e que persiste na mosca adulta. Estes serão também localizados nos cromossomos através de hibridizações in situ. (subprojeto 2); 3. Sequenciar clones de transcriptomas, a partir de RNA de ovários de rainhas (possibilitando a identificação de mensagens maternas nos ovos e envolvidas no desenvolvimento embrionário) e de RNA de uma mistura de corpo gorduroso, hemolinfa, Malpighi, gânglios nervosos, glândulas e músculo de diversas castas (para a identificação de mensagens envolvidas em diferentes processos biológicos, tais como defesa, comportamento e comunicação). A expectativa desta proposta é de identificar a maior quantidade possível de transcritos. Utilizando mensageiros originados de diferentes tecidos e de diferentes castas pode-se viabilizar em um futuro a curto e médio prazo experimentos de "microarray", SAGE, RACE e RT-PCR. Este subprojeto pretende também construir uma biblioteca genômica com insertos de alto peso molecular clonados em BACs a partir de DNA genômico mecanicamente fragmentado. Tal biblioteca devidamente construída e armazenada pode virtualmente representar redundantemente todo o genoma de Atta. Outros possíveis frutos destas abordagens seria a viabilidade de experimentos de genômica comparativa, a geração de um mapa citogenético de alta resolução a partir de "fingerprints" e hibridizações in situ de clones específicos, bem como seria importante para o fechamento de "Gaps" em uma iniciativa de seqüenciamento em larga escala. Esta biblioteca de alto peso molecular (BAC) e a confecção destas membranas voltadas a varreduras permanecerão à disposição de qualquer pesquisador com interesse no modelo. (AU)