Estudo dos mecanismos de ação pelos quais o estradiol estimula síntese de PGF2alfa endometrial em fêmeas bovinas

• Processo: 12/50767-3
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2013
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2015
• Área do conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
• Acordo de Cooperação: CNPq - Programa Primeiros Projetos
• Pesquisador responsável: Claudia Maria Bertan Membrive
• Beneficiário: Claudia Maria Bertan Membrive
• Instituição Sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental de Dracena. Dracena , SP, Brasil
• Assunto(s): Prostaglandinas Endométrio Estradiol Dinoprosta Bovinos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Bovino | Endometrio | Pkc | Pla2 | Prostaglandina F2A

Resumo

Em fêmeas bovinas a liberação de PGF2α pode ser induzida in vivo pelo estradiol (E2), entretanto, o papel do E2 na síntese de PGF2α ainda não foi esclarecido. Considerando que as concentrações plasmáticas de PGF2α aumentam 3,5 hms após a aplicação do E2 in vivo, acredita-se que o E2 ative não somente enzimas, mas também estimule a síntese de proteínas essenciais para a produção de PGF2α. Sabe-se que explantes endometriais bovinos provenientes de animais injetados com E2, e cultivo de células endometriais bovinas (BEND) expostas ao E2, ao serem tratados com ionóforo de cálcio (Cl) tiveram um aumento acentuado na liberação de PGF2cx quando comparados àqueles que não receberam E2 e aos tratados exclusivamente com E2 ou CL A hipótese é que o E2 estimule a expressão e/ou a atividade ias enzimas PKC e PLA2, ambas dependentes de cálcio para a ativação, envolvidas na síntese de PGF2α endometrial. O objetivo geral deste estudo é verificar a ação do E2 na atividade das proteínas PKC e PLA2 envolvidas na cascata geradora de PGF2α (Experimento 1); identificar grupos de genes envolvidos na síntese de PGF2α endometrial em fêmeas bovinas, cuja expressão seja modulada pelo E2 pela técnica de RT-qPCR (Experimento 2) e posteriormente comprovar as proteínas identificadas como diferenciadas no experimento 2 pela técnica de Western Blotting (Experimento 3). No Experimento 1. células endometriais bovinas (BEND) serão cultivadas e submetidas a presença ou ausência de um inibidor específico de PKC (10μM Bisindolimaleide I) ou inibidor de PLA2 (20μM, AACOCF3), durante 60 minutos. Amostras de meio de cultivo, no volume de 100μL, serão coletadas 60 minutos após a adição ou não dos diferentes inibidores (Tempo 0). Imediatamente após, será adicionado 100μL de meio sem soro contendo ou não E2 + CI, que será acrescentado aos 900μL restantes nos poços, em quantidade que determine uma concentração final de 10-6M de cálcio ionóforo e 10-13M de estradiol. Amostras de meio, no volume de 100μL, serão coletadas 12 horas após o tratamento ou não com CI (Tempo 12). Os tratamentos serão realizados em triplicata em um total de cinco repetições. As concentrações de PGF2α no meio de cultivo serão mensuradas por radioimunoensaio. A média e erro padrão da média (EPM) para a DIF 12, representada pela diferença de concentração entre o Tempo 12 e 0 Tempo 10, será comparada entre os diferentes grupos de tratamento. No Experimento 2. fêmeas Nelore cíclicas (n=60), não lactantes, serão pareadas no dia 17 de um ciclo estral sincronizado, injetadas com 0mg (n=30) ou 3mg de17β-estradiol (n=30) e em seguida serão subdivididas dentro de cada grupo para terem uma biópsia uterina do como uterino ipsolateral ao corpo lúteo realizada com 2 horas (n=6 para 0mg e n=6 para 3mg de17β-estradiol) ou 3 horas (n=6 para 0mg e n=6 para 3mg de17β-estradiol) ou 4 horas (n=6 para 0mg e n=6 para 3mg de17β-estradiol) ou 5 horas (n=6 para 0mg e n=6 para 3mg de17β-estradiol) ou 6 horas (n=6 para 0mg e n-6 para 3mg de17β-estradiol). As amostras teciduais serão avaliadas quanto à expressão de RN Am, pela técnica de RT-qPCR, para algumas proteínas específicas envolvidas na síntese de PGF2α endometrial, dentre estas aldo-keto redutase1B1, Aldo-keto redutase 1C3, receptor de ocitocina, fosfolipase A24A, PKCα, PKCβ, PKCγ, cicloxigenase 1 e cicloxigenase 2. Neste estudo, espera-se identificar grupos de genes envolvidos na síntese de PGF2α endometrial em fêmeas bovinas, cuja expressão seja … (AU)