Transformação do Paracoccidioides brasiliensis com plasmídeos contendo cassetes visando a deleção do gene PbGP43 e a interferência de RNA desse gene e do PbMDJ1

• Processo: 05/53555-3
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2005
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2007
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Biologia e Fisiologia dos Microorganismos
• Pesquisador responsável: Rosana Puccia
• Beneficiário: Milene Carmes Vallejo
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Transformação genética Expressão gênica Expressão de proteínas Plasmídeos Paracoccidioides brasiliensis
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Delecao Genica | Irna | Paracoccidioides Brasiliensis | Pbgp43 | Pbmdj1 | Transformacao

Resumo

O objetivo do projeto é a construção de plasmídos contendo cassetes específicos e sua utilização na obtenção de cepas de Paracoccidioides brasiliensis transformadas: 1. com cassetes para a inativação do PbGP43 (o laboratório já dispõe de 3 cassetes para esse fim) e com o plasmídeo controle contendo o gene de resistência à higromicina; 2. com cassetes que visam à interferência de RNA dos genes PbGP43 e PbMDJ1. O destino do DNA dentro da célula será avaliado através de PCR e Southern blot. O efeito na expressão gênica será avaliado através de RT-PCR e Northern blot. O efeito na expressão protéica será avaliado através de reações imunológicas como dot-blot, Western blot e imunofluorescência, já que dispomos de anticorpos que reconhecem tanto a gp43 (antígeno majoritário, protetor e ligante de proteínas de matriz extracelular), como a PbMdj1 (proteína de choque térmico, chaperone mitocondrial que foi também por nós localizada na parede do fungo). As estratégias de transformação serão a eletroporação e co-cultura com Agrobacterium tumefaciens, usando vários isolados de P. brasiliensis. Parte desse projeto começou a ser desenvolvido por um aluno de iniciação científica (proc. 04/00457-1) que não continuou na pós-graduação. O aluno conseguiu transformantes, porém não estáveis. A manipulação genética em P. brasiliensis é essencial no estudo do fungo, e certamente possível, já que foi recentemente estabelecida para fungos dimórficos filogeneticamente próximos. Esse projeto poderá derivar um doutorado direto. (AU)