Produção de tropomiosina funcional em E. coli e seu uso em estudos de cross-linking com actina

• Processo: 92/02119-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 1992
• Data de Término da vigência: 29 de fevereiro de 1996
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Fernando de Castro Reinach
• Beneficiário: Patricia Brant Monteiro
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Tropomiosina Actinas Escherichia coli

Resumo

A tropomiosina (Tmy) exerce uma função regulatória no músculo esquelético. A molécula presente no músculo é acetilada e liga 7 moléculas de actina. A Tmy expressa em E. coli não é acetilada e não liga actina (Heald e Hitchcock-De Gregori. 1988). Quando expressamos a Tmy em E. coli na forma de fusão com 2 nu 3 aminoácidos no N-terminal, a ligação à actina foi restabelecida. Nestas proteínas, o grupo alfa-amino da Met 1 está envolvido numa ligação peptídica comparável à ligação amida na Tmy acetilada. Usando estas tropomiosinas recombinantes, pretendemos mapear os resíduos de Tmy que interagem com a actina através de estudos de "cross-link". Para obter um único "cross-link", utilizaremos um reagente heterobifuncional específico p ar a cisteína, o qual será ligado a cisteinas colocadas em diferentes posições da Tmy e em seguida "cross-linked" ao resíduo de actina mais próximo por fotoativação. Os produtos da reação de "cross-link" serão clivados e sequenciados para identificação do sitio de "cross-link" entre a Tmy e a actina. (AU)