CARACTERIZACAO DO PADRAO DE INTEGRACAO DO RETROVIRUS pMFG-FVIII-P140K EM LINHAGENS CELULARES HUMANAS PRODUTORAS DE FATOR VIII RECOMBINANTE.

• Processo: 08/52267-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2008
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2010
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Aparecida Maria Fontes
• Beneficiário: Marcela Cristina Corrêa de Freitas
• Instituição Sede: Hemocentro de Ribeirão Preto. Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP (HCMRP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Fator VIII Mutagênese Estabilidade
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Estabilidade | Fator Viii | Linhagem Celular Hepg2 | Mutagenese

Resumo

A hemofilia A é uma desordem sangüínea ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência ou anormalidade do fator VIII (FVIII). A terapia atual para a hemofilia consiste na infusão de concentrados de FVIII, podendo este ser de plasma humano ou de FVIII recombinante. O FVIII exibe fatores limitantes para a obtenção de um elevado nível de sua expressão, como por exemplo, o tamanho do gene, seu baixo nível de expressão e a secreção ineficiente do produto desse gene. Maneiras de contornar esses problemas consistem: 1) utilização do sistema de transferência gênica viral; 2) emprego de reagentes químicos para a seleção de um clone celular com altos níveis do fator VIII recombinante e 3) construção de mutações pontuais não sinônimas, que permitem a geração de uma proteína mais estável. Neste contexto, o objetivo do presente estudo consiste na geração de uma nova proteína referente ao FVIII com uma mutação pontual visando a estabilização da proteína. A molécula molde consistirá na proteína recombinante FVIIIDB-I-140K previamente gerada em nosso laboratório. Para isso será realizada a mutagênese sítio dirigida do cDNA relativo ao fator VIIII presente no vetor retroviral pMFG-I-P140K. Após a geração da construção recombinante será efetuada a transfecção desse vetor retroviral na linhagem celular RetroPack e posterior transdução do sobrenadante dessa última, na linhagem hepática HepG2. Após o tratamento com as drogas quimioterapêuticas Benzil Guanina e Temozolomide será selecionado um clone celular de HepG2/FVIIIdb-I-P140Ke com altos níveis do fator VIII recombinante pela análise da expressão do mRNA relativo ao rFVIII por RT-PCR em tempo real e da atividade biológica pelo teste APTT (teste da tromboplastina parcialmente ativada). (AU)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

FREITAS, Marcela Cristina Corrêa de. Caracterização do padrão de integração do retrovírus pMFG-FVIII-P140K em linhagens celulares humanas produtoras de fator VIII recombinante. 2011. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC) Ribeirão Preto.