Aminopeptidase N e as catepsinas Ls de Tenebrio molitor

• Processo: 10/19002-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2011
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2011
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
• Pesquisador responsável: Walter Ribeiro Terra
• Beneficiário: Ticiane Fraga Damasceno
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 07/50320-0 - A digestão nos insetos: uma abordagem molecular, celular, fisiológica e evolutiva, AP.TEM
• Assunto(s): Catepsina L
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: aminopeptidase | Catepsina L | especificidade de substrato | mutações sítio-dirigidas | Bioquimica de insetos

Resumo

A digestão nos insetos: uma abordagem molecular, celular, fisiológica e evolutiva.Após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente, uma compreensão da função intestinal foi considerada essencial para o desenvolvimento de novos métodos de controle agindo através do intestino, tais como o uso de plantas transgênicas para controlar insetos fitófagos. (A. Rev. Biochem. 61:87-111, 1992). O nosso laboratório escolheu a estratégia de estudar detalhadamente insetos-modelo dispostos em pontos relevantes da árvore filogenética, a fim de produzir generalizações (A. Rev. Ent. 35: 181-200, 1990; Comp. Biochem. Physiol. B 109: 1-62, 1994; Comprehensive Molecular Insect Science, vol. 4, Oxford, Elsevier, pp. 171-224, 2005). Os resultados mostraram que o processo digestivo nos insetos organiza-se em padrões filogeneticamente determinados e permitiram o levantamento de hipóteses sobre o papel da membrana peritrófica (Arch. Insect Biochem. Physiol 47: 47-61, 2001) e das membranas perimicrovilares dos Hemíptera (percevejos, cigarras e pulgões) (An. Acad. Bras. Cienc. 78: 255-269, 2006). O desenvolvimento do setor passa pela ampliação do conhecimento dos eventos moleculares subjacentes aos fenômenos fisiológicos intestinais. O presente projeto aborda todos os aspectos relacionados dentro das subdivisões: (a) Estudo das enzimas digestivas; (b) Fisiologia molecular intestinal; (c) Bases moleculares dos diferentes mecanismos de secreção intestinal de enzimas e (d) Evolução dos sistemas digestivos dos insetos. As enzimas digestivas serão estudadas utilizando procedimentos descritos em nossas revisões (já citadas e mais Insect Biochem. Molec. Biol. 35: 883-901, 2005; Acta Crys. F62: 750-752, 2006). O objetivo é procurar as causas estruturais e cinéticas das peculiaridades das enzimas digestivas que possibilitam os insetos contornar as defesas das plantas. As seguintes enzimas terão os seus cDNAs codificantes clonadas, serão expressas e as proteínas recombinantes submetidas a estudos funcionais (mutações sítio-dirigidas) e estudos cristolográficos: tripsina e quimotripsina de P. americana, T. molitor, M. domestica e D. saccharalis; catepsinas L (CALs), trealase e aminopeptidase N de T. molitor; trealase, b-glicosidase e laminarinase de S. frugiperda, laminarinase de ª flavolineata. As enzimas a seguir serão seqüenciadas e caracterizadas cineticamente: CALs de D. peruvianus, a-manosidase de T. molitor e amilases de D. saccharalis. Modelos da fisiologia molecular intestinal de D. peruvianus, T. molitor, M. domestica e S. frugiperda serão formulados em 2 etapas: (a) sequenciamento ao acaso de bibliotecas de cDNA intestinal, geração de anticorpos relativos aos clones mais interessantes e seu uso em imunocitolocalizações para gerar hipóteses provisórias. (b) Testes de hipóteses funcionais por supressão da expressão de proteínas escolhidas por RNAi e avaliação dos efeitos. Os mecanismos de secreção de algumas enzimas em insetos parecem incluir aspectos que não são encontrados em outros animais (revisões). Para esses estudos, varreduras de bibliotecas de cDNA intestinal de expressão com anticorpos contra proteínas do citoesqueleto microvilar (S. frugiperda), do ápice celular (T. molitor) e microvilares (ambos insetos) identificarão clones positivos. Esses suportarão hipóteses de mecanismo de secreção em procedimento com duas etapas, como as mencionadas para o estudo da fisiologia molecular intestinal. O desenvolvimento da hipótese evolutiva dos sistemas digestivos dos insetos deverá incluir estudos da fisiologia digestiva de insetos não considerados até agora, como o grilo e o bicho-pau e avançar no estudo das membranas perimicrovilares em Thysanoptera.