Identificação de proteínas/complexos proteicos capazes de modular a expressão gênica em Neurospora crassa em situação de estresse térmico

• Processo: 12/22993-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2013
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2013
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Bioquímica de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Maria Celia Bertolini
• Beneficiário: Fernanda Zanolli Freitas
• Supervisor: N. Louise Glass
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of California, Berkeley (UC Berkeley), Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 10/01555-8 - Análise funcional da região promotora do gene GSN que codifica a enzima glicogênio sintase no fungo Neurospora crassa: identificação e caracterização do(s) fator(es) de transcrição que modulam a expressão gênica, BP.PD
• Assunto(s): Biologia molecular Regulação da expressão gênica Neurospora crassa
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: ChIP-seq | estresse térmico | Regulação da expressão gênica | RNA-seq | Biologia Molecular

Resumo

O controle da expressão gênica em organismos eucariotos é determinado por um complexo código regulatório transcricional, que pode ser descrito como um conjunto de interações entre inúmeros fatores de transcrição e diferentes sequências de DNA regulatórias, presentes nos respectivos genomas. São estas possíveis combinações, somadas a alterações significativas que ocorrem simultaneamente na estrutura da cromatina, que respondem pela competência com a qual um dado evento de transcrição deve ocorrer ou não. Desta maneira, a detecção de interações DNA-proteínas e proteínas-proteínas in vitro se tornam imprescindíveis para a detecção destas mesmas interações in vivo. Dado que estas interações possam resultar na remodelagem da cromatina em regiões regulatórias, identificá-las e avaliar suas contribuições na dinâmica da cromatina in vivo auxilia muito no entendimento do código regulatório da transcrição. O projeto em questão propõe identificar complexos proteicos envolvidos no controle do metabolismo do glicogênio no fungo Neurospora crassa na situação de estresse térmico. O glicogênio é o principal carboidrato de reserva em diferentes células e seu metabolismo é bastante conservado nos eucariotos, sendo a enzima glicogênio sintase limitante do processo de biossíntese, uma vez que responde pela elongação da molécula do carboidrato. Em N. crassa, a glicogênio sintase é codificada pela ORF NCU06687 (gene gsn). Estudos anteriores mostraram que a expressão do gene gsn é regulada negativamente no choque térmico (45°C) e que esta modulação é dependente da presença dos elementos de DNA regulatórios STRE no promotor do gene. Técnicas bioquímicas acopladas à espectrometria de massas permitiram identificar proteínas nucleares de funções ainda desconhecidas e capazes de ligar a elementos STRE presentes na região 5'-flanqueadora do gene gsn (produtos das ORFs NCU03482, 06679 e 02671). Análises in silico das sequências polipeptídicas destas proteínas permitiram a identificação de seus ortólogos funcionais em outros organismos. O produto da ORF NCU03482 tem uma alta identidade com a proteína humana RUVBL1, enquanto que a proteína codificada pela ORF NCU06679 apresenta alta identidade com a proteína RBB4 humana e NURF55 de Drosophila. Ambas as proteínas tiveram suas estruturas resolvidas por modelagem molecular, baseando-se nos ortólogos estruturais depositados em bancos de dados. A ORF NCU02671 se encontra anotada como um gene codificando uma proteína de ligação ao box-G da cutinase, contendo dois domínios de ligação ao DNA do tipo Zn+2-finger C2H2 localizados na região C-terminal da molécula. A análise in silico de sua sequência revelou que esta proteína apresenta uma alta identidade na região do domínio de ligação ao DNA com o fator de transcrição Seb1 de Trichoderma atroviridae, um ortólogo funcional dos transativadores Msn2p/4p de Saccharomyces cerevisiae, que liga o motivo STRE durante o estresse osmótico. Considerando que após a finalização do genoma do fungo apenas 40% dos genes identificados correspondem a proteínas conhecidas e que o restante compreende proteínas desconhecidas, N. crassa se torna um organismo modelo bastante promissor para a identificação de novas proteínas e atribuição de funções a elas. O presente projeto tem como principal objetivo se beneficiar deste fato, buscando proteínas parceiras das proteínas já identificadas que possam fazer parte de complexos proteicos regulatórios do gene gsn na situação de estresse térmico e que até o presente momento, ainda permanecem desconhecidas (AU)