Expressão e Purificação de Transportadores do Tipo ABC de Mycobacterium tuberculosis para Estudos Funcionais e Estruturais - Uma Plataforma para Produção de Proteínas de Membrana

• Processo: 12/23469-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2013
• Data de Término da vigência: 30 de agosto de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Bioquímica de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Andrea Balan Fernandes
• Beneficiário: Ana Leticia Gori Lusa
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Bolsa(s) vinculada(s): 14/19570-4 - Análise funcional e estrutural de transportador ABC de glutamina em Mycobacterium tuberculosis., BE.EP.PD
• Assunto(s): Proteínas da membrana Resistência microbiana a medicamentos Transportadores de cassetes de ligação de ATP Tuberculose
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Proteinas de membrana | resistencia a antibióticos | resistência a multidrogas | transportadores ABC | Tuberculose | proteinas de membrana

Resumo

Proteínas de membrana são consideradas os novos desafios da Biologia Estrutural dada a sua relevância médica. Mais de 50% dos alvos da indústria farmacêutica envolvem estas proteínas as quais representam cerca de 30% dos genomas de organismos. Com o objetivo de montarmos uma plataforma para a expressão e produção de proteínas de membrana em nosso laboratório, para uso em ensaios funcionais in vitro e estudos estruturais, escolhemos como alvos os transportadores do tipo ABC de Mycobacterium tuberculosis, uma das maiores famílias de proteínas integrais de membrana. Transportadores ABC são relacionados ao desenvolvimento do fenômeno de múltipla resistência à drogas (MDR) no tratamento do câncer e resistência bacteriana, incluindo em tuberculose. Apesar de identificados, não existem estudos funcionais sobre a extensa maioria dos transportadores ABC de M. tuberculosis e a possibilidade de caracterização de suas funções, bem como definição da faixa de substratos, é um passo para o desenvolvimento de novas formas de controle da doença. Neste sentido, pretende-se expressar, purificar e produzir os transportadores em membranas reconstituídas para estudos de interação com diferentes substratos, caracterização da atividade e análises estruturais. Para a realização deste projeto, estabelecemos uma colaboração com as pesquisadoras Dra. Isabel de Moraes, chefe do Membrane Protein Laboratory do Diamond Light Source e Dra. Louise Bird do Oxford Protein Production Facility (OPPF) em Didcot, Inglaterra. Esta colaboração visa a clonagem inicial e análise de expressão em larga escala de todos os transportadores para identificação dos alvos mais promissores. Os resultados preliminares mostram que dos 17 transportadores de M. tuberculosis clonados em diferentes vetores de expressão, três foram expressos com sucesso e em quantidades suficientes para os estudos iniciais (dois exportadores de drogas: Rv1747 e Rv1819c e um transportador de glutamina Rv2563/2564). A otimização das condições de expressão destes transportadores e as melhores condições de purificação, bem como a sub-clonagem dos demais transportadores com outras abordagens estão em andamento.