Projeto: Novos mecanismos celulares, moleculares e imunológicos nas lesões renais agudas e crônicas: busca por novas estratégias terapêuticas

• Processo: 14/21192-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2014
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunologia Celular
• Pesquisador responsável: Niels Olsen Saraiva Câmara
• Beneficiário: José Wellington Tiburcio da Silva
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 12/02270-2 - Novos mecanismos celulares, moleculares e imunológicos das lesões renais agudas e crônicas: busca por novas estratégias terapêuticas, AP.TEM
• Assunto(s): Técnicas de genotipagem Fisiopatologia renal Macrófagos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Fisiopatologia Renal | Genotipagem | m TOR | Macrófago | túbulo-intersticial | Imunologia dos Transplantes

Resumo

Plano de Trabalho - Bolsa de Apoio Técnico TT2Projeto: Novos mecanismos celulares, moleculares e imunológicos nas lesões renais agudas e crônicas: busca por novas estratégias terapêuticas. Coordenador: Niels Olsen Saraiva CâmaraBolsista: A ser indicado1.Plano de Trabalho: O bolsista irá trabalhar dentro dos subprojetos dentro do auxílio temático: Projeto 3. Participação da via de sinalização mTOR na ativação de macrófagos na fisiopatogenia da lesão renal glomerular e túbulo-intersticialProjeto 4. Ativação de macrófagos na doença renal crônica experimentalTais subprojetos têm os seguintes objetivos:a.Avaliar o papel dos macrófagos no desenvolvimento e na fase de extensão da doença renal glomerular e túbulo-intersticial;b.Estudar o papel da sinalização via mTOR no desenvolvimento e na fase de extensão da doença renal glomerular e túbulo-intersticial; c.Avaliar o grau de angiogênese e a expressão de VEGF;d.Determinar a taxa de apoptose e em quais células ela ocorre e o grau de hipóxia tissular;e.Caracteriza as populações celulares infiltrantes no rim na presença ou ausência de via mTOR funcionante; f.Avaliar a participação de citocinas e quimiocinas no desenvolvimento e na fase de extensão da doença renal glomerular e túbulo-intersticial, na presença ou ausência de via mTOR funcionante;Isso será realizado seguindo as seguintes etapas:a)Genotipagens dos animais geneticamente modificados para seleção, cruzamento e uso nos experimentos.b)Realizar os experimentos dosagens bioquímicas para caracterização da doença.c)Organização do laboratório:a.Compra de reagentesb.Manutenção dos equipamentosd)Apresentação de artigos científicos nas reuniões e de relatórios com os resultados do presente trabalho2. Abordagem experimental usada nos subprojetos.De uma maneira geral nossa abordagem experimental será baseada em modelos experimentais in vivo e in vitro da GESF.O desenvolvimento da GESF experimental será realizado através do clássico modelo de GESF induzida por ADM. Após a injeção da droga os animais serão acompanhados por diversos pontos de estudo nos quais serão realizados coletas de sangue, urina e rins dos animais. Os materiais serão submetidos a várias técnicas (descritas no temático) visando sempre o foco no papel da via mTOR em macrófagos e seu impacto no desenvolvimento da GESF. Além de animais selvagens (WT), animais nocautes e do tipo Cre-Lox serão utilizados (para hiperexpressar a via mTOR especificamente em macrófagos) e também serão feitos tratamentos com vistas a depletar os macrófagos dos animais. Atividades a serem desenvolvidas pelo técnico TT2Metodologia padrão.a) As avaliações funcionais serão realizadas utilizando-se amostras de sangue e urina. Breve, os animais ficarão em gaiolas metabólicas por 24 horas, onde serão coletadas urina e sangue. Serão medidos creatininas plasmática e urinária, por Cobas auto analyzer (Roche Diagnostics, Division of Hoffman-La Roche, Inc., Nutley, NJ, USA), e uréia séricas.Clearance de inulina e proteinúria serão também aferidos. Albuminúria será avaliada por imunodifusão indireta utilizando anticorpo contra albumina de camundongos, e de forma indireta estimativa de densidade de banda em corrida de gel de poliacrilamida.b) Gentotipagem dos animais Cre-Lox para manutenção das colônias. Nesta etapa, será extraído o DNA cortando 2mm da cauda de cada animal e adicionardo 75ul (25mM) NaOH (0,2mM) EDTA. Então, será incubado por 98oC por 1h e encerrado a extração adicionando 75ul (40mM) em Tris-HCl ph 5,5. Utilizando 0,5ul deste produto, será realizado a PCR com primers específicos para o gene a ser analisado de acordo com as concentrações padrões. A analise dos produtos será feita em gel de agarose 3% marcado com SybrSafe de acordo com as instruções do fabricante. Os cruzamentos dos animais CRE-Lox deverão ser feitos inicialmente para se formar animais heterozigotos em F1 e um novo cruzamento de animais F1 com