Capacitação em técnicas de histologia, imuno-histoquímica e microscopia

• Processo: 15/03492-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2015
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Farmacologia - Neuropsicofarmacologia
• Pesquisador responsável: Francisco Silveira Guimaraes
• Beneficiário: Flávia Corrêa Turcato
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 12/17626-7 - Mecanismos celulares e moleculares envolvidos no papel de neurotransmissores atípicos em transtornos neuropsiquiátricos, AP.TEM
• Assunto(s): Imuno-histoquímica Psicofarmacologia Microscopia Microinjeções
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: imuno-histoquímica | Microinjeções | microscopia | Psicofarmacologia

Resumo

Resumo e objetivos: O bolsista será capacitado a realizar técnicas de histologia (perfusão de animais e cortes histológicos), ensaios de imuno-histoquímica e análise por microscopia ótica necessários aos grupos 1, 2, 3, 7 e 9 de subprojetos. Além disso, será treinado a realizar análise por microscopia confocal em aparelho que estamos adquirido para o grupo.Plano de trabalho: Metodologias a serem empregadas: 1. Localização de sítios de injeção intra-cerebral. Os animais serão anestesiados com uretana 25% (5 ml/kg) e perfundidos intracardiacamente com salina 0,9% e formol 10%. Após será inserida uma microagulha pela cânula-guia e injetados 0,2 ¼l de corante fast green 0,1%. Os cérebros serão retirados, estocados em formol 10% (2-3 dias) e cortados em seções de 40 ¼m para verificação microscópica do local de injeção, segundo os diagramas do atlas de Paxinos e Watson (1997). 2. Imuno-histoquímica. Os animais serão sacrificados com injeção intraperitoneal (i.p.) de uretana (25%, 5 ml/Kg de peso) e perfundidos transcardiacamente com salina e paraformaldeído 4% fosfatado e tamponado em PBS 0,1 M, pH 7,4. Os cérebros serão removidos e processados para obtenção de cortes representativos, em duplicata, das regiões a serem investigadas (De Oliveira (2001). As secções serão inicialmente pré-tratadas com H2O2 1% em PBS 0,1M durante 10 minutos, para redução da atividade da peroxidase endógena. Após 3 lavagens de 10 minutos cada, em PBS 0,1M (pH 7,4) as secções serão incubadas com soro albumina bovina (BSA) 1% em PBS 0,1M acrescido de Triton-X 0,02% (PBS-T), durante 1 hora, para bloqueio dos sítios de ligações inespecíficas. Em seguida, as secções serão incubadas com o anticorpo primário. Após 30 h de incubação à temperatura ambiente, as secções serão novamente lavadas em PBS 0,1M (3 x 10 minutos) antes de serem incubadas com o anticorpo secundário biotinilado (1:1.500) por mais 2 horas. Os anticorpos serão diluídos em PBS-T + BSA, e todas as incubações realizadas à temperatura ambiente com agitação constante. Uma vez removido o anticorpo secundário, através de sucessivas lavagens em PBS 0.1M (3 x 10 minutos), as secções serão incubadas com o complexo ABC avidina-biotina-peroxidase (1:1.500, Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories), por 1 hora. A atividade da peroxidase será revelada usando o tetracloreto de 3'3'-diaminobenzidina (DAB) contendo H2O2 0,02%. Finalmente, após lavadas, as lâminas serão desidratadas através de uma série de álcoois (70%, 80%, 95% e 100%, 5 minutos cada), clareadas no xilol (2 x 10 minutos) e cobertas com Permount e lamínulas (pequenas variações deste protocolo poderão ocorrer com anticorpos específicos). 3. Imunofluorescência: Semelhante acima, mas as secções serão incubadas durante 1h com anticorpos secundários específicos (Alexa Fluor 350, emissão de fluorescência azul,Alexa Flúor 488, emissão de fluorescência verde e Alexa Fluor 594, emissão de fluorescência vermelha). Após as lavagens, as lâminas serão cobertas por lamínulas usando Fluoromount (Electron Microscopy Science) como meio de montagem e em seguida serão vedadas com esmalte para evitar o ressecamento. 4. Análise de resultados por microscopia ótica e confocal. A quantificação ótica será feita utilizando um analisador de imagens digitalizadas (Image-Pro Plus, Media Cybernetics) e microscópico confocal Leica TCS SPE.