Clonagem e expressão da proteína CDK8 (quinase humana dependente de ciclina)

• Processo: 15/04161-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2015
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Fernanda Canduri
• Beneficiário: Danielle Karoline Silva Do Vale Castro
• Instituição Sede: Instituto de Química de São Carlos (IQSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Expressão heteróloga Proteínas quinases Atividade enzimática Fosforilação Ciclo celular RNA polimerase II Cromatografia líquida de alta eficiência
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cdk8 | expressão heteróloga | Proteínas quinases | Química de Proteínas

Resumo

As proteínas quinases dependentes de ciclina humana (CDKs) compreendem uma família de proteínas serina/treonina quinase cuja atividade é dependente da associação de duas subunidades. Uma subunidade capaz de regular positivamente (ciclina) ou negativamente (inibidores de CDK) e uma subunidade catalítica, a proteína quinase, regulada através de reações sítio específicas de fosforilação e desfosforilação que ocorrem no resíduo de treonina. Os estudos destas proteínas têm se tornado importante devido à intensa participação na regulação de eventos essenciais para o desenvolvimento celular como o ciclo celular e a transcrição. Assim, a regulação do ciclo celular é importante para ambos os processos, uma vez que a atividade da RNA polimerase II é modulado durante o ciclo celular onde ocorrem variações no estado de fosforilação do domínio carboxi-terminal (CTD) de sua subunidade maior, e está intimamente envolvida no desenvolvimento de doenças relacionadas à divisão celular, como o câncer. As CDKs regulam esses eventos celulares através de reações de fosforilação e desfosforilação, sendo que os mecanismos que permitem que a proteína atue são os estados de fosforilação da subunidade quinase, degradação controlada da subunidade ciclina, síntese gradual de CDK e ciclina e ação de proteínas inibidoras de CDKs. As CDKs 7-9 são importantes reguladores transcricionais, sendo a CDK8 a mais complexa, uma vez que tem sido associada a efeitos positivos e negativos sobre a transcrição. O estudo destas proteínas contribui para o entendimento da relação estrutura-função destas e sua relação com oncogenes e supressores de tumor. O presente projeto de pesquisa tem como objetivo clonar o cDNA da CDK8, expressá-la em sistema bacteriano e purificá-la por cromatografia de alta eficiência. Após sua obtenção, serão realizados ensaios para determinação de sua estrutura secundária, bem como ensaios de atividade enzimática na presença de inibidores.