Investigação de possíveis heteromorfismos cromossômicos sexuais em espécies de Pseudis e Lysapsus pela técnica de CGH (Comparative Genomic Hybridization)

• Processo: 15/06902-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2015
• Data de Término da vigência: 29 de fevereiro de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Animal
• Pesquisador responsável: Luciana Bolsoni Lourenço
• Beneficiário: Karin Regina Seger
• Instituição Sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 14/23542-6 - Citogenética molecular comparativa em anuros do gênero Pseudis com ênfase no estudo de cromossomos sexuais, AP.R
• Assunto(s): Citogenética Cromossomos sexuais Anfíbios
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Anfíbios | Cromossomos sexuais | Citogenética

Resumo

Amostras de DNA obtidas de fígado de machos e fêmeas de Pseudis e Lysapsus serão marcadas com FITC-12-dUTP - Roche e Cy-3-dCTP - GE Healthcare, ou Biotin-16-dUTP - Roche e Digoxigenin-11-dUTP, com o auxílio dos kits Nick Translation Kit - Roche ou NickTranslation - GE Healthcare, de acordo com as instruções dos fabricantes. Cerca de 1 ¼g dasonda do genoma de macho marcada com FITC (ou biotina) e 1 ¼g da sonda do genoma de fêmea marcada com Cy-3 (ou digoxigenina) serão co-precipitadas na presença de 4 ¼g de DNA competidor1 e 1 ¼g de DNA de esperma de salmão. As sondas serão ressuspensas em solução de hibridação (50% de formamida, 2x SSC e 10% de dextran sulfato). Preparações cromossômicas das espécies a serem estudadas serão tratadas com RNase (100 ¼g/mL) por uma hora em câmara úmida e, em seguida, lavadas em três banhos (de 3 minutos cada) de 2x SSC e desidratadas em série de etanol (50, 75 e 100%). As preparaçõescromossômicas serão desnaturadas em solução de formamida (70% de formamida em 2x SSC) a 70ºC por 2 minutos, sendo em seguida banhadas em 2x SSC gelado (2 minutos) e desidratadas em série de etanol gelado. As sondas serão desnaturadas por 10 minutos a 96oC e colocadas sobre as preparações cromossômicas. As lâminas serão deixadas em câmara umedecida com formamida, mantida a 37oC, por dois dias. As preparações cromossômicas serão então lavadas em solução de formamida (50% de formamida em 2x SSC) a 37 oC (2minutos cada) e posteriormente em solução salina (2x SSC) a 37 oC (dois banhos de 2 minutoscada). As lâminas serão deixadas em PBT (1x de PBS, 0,8% de BSA e 0,1% de Tween 20)por 5 minutos à temperatura ambiente. A solução de PBT será trocada por nova e depois de 5minutos será realizada a etapa de detecção das sondas. Para tanto, 100 ¼L do anticorpo antidigoxigeninaconjugado com rodamina - Roche (600 ng/¼L) será aplicado sobre as preparações cromossômicas e estas incubadas em câmara úmida com PBT por 45 minutos. Após este tratamento, as lâminas passarão por dois banhos de PBT (5 minutos em cada banho). As preparações cromossômicas serão coradas com DAPI (0,5 ¼g/mL) e observadasem microscópio de fluorescência Olympus Bx60 com câmera digital (Q-Color3). As imagensserão editadas com o auxílio dos softwares Adobe Photoshop CS3 e/ou Image ProPlus 4.0(Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

GATTO, KALEB PRETTO; SEGER, KARIN REGINA; DE ANCHIETA GARCIA, PAULO CHRISTIANO; LOURENCO, LUCIANA BOLSONI. Satellite DNA Mapping in Pseudis fusca (Hylidae, Pseudinae) Provides New Insights into Sex Chromosome Evolution in Paradoxical Frogs. GENES, v. 10, n. 2, FEB 2019. (14/23542-6, 15/06902-1)