Estudos estruturais e calorimétricos com a importina-alfa do fungo Neurospora crassa e sequências de localização nuclear de fatores de transcrição

• Processo: 16/09314-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2016
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2018
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Marcos Roberto de Mattos Fontes
• Beneficiário: Hamine Cristina de Oliveira
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/24705-3 - O fungo filamentoso Neurospora crassa como um organismo modelo para a caracterização funcional de proteínas/fatores de transcrição que regulam o metabolismo de carboidratos, AP.TEM
• Assunto(s): Biologia molecular Neurospora crassa Carioferinas Núcleo celular Saccharomyces cerevisiae Fatores de transcrição Processos bioquímicos Cristalografia estrutural Calorimetria
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Importina alfa | Neurospora crassa | transporte nuclear | Biologia Molecular Estrutural

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nesta via, proteínas que contém as clássicas sequências de localização nuclear (NLSs) são importadas para o núcleo pelo heterodímero importina-alfa/beta. A Importina-alfa (ImpA) contém o sítio de ligação do NLS, enquanto a Importina-beta (ImpB) media o transporte através do poro da membrana nuclear. O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX. Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Imp± de Neurospora crassa (ImpANc) bem como da sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína no reconhecimento de NLSs. Foram reconhecidos NLSs em proteínas relacionadas ao metabolismo de glicogênio e resposta a variações de luz em fungos. Dentre os mecanismos responsáveis pelo regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-alfa/beta é um dos principais processos. Nesse processo, o estudo estrutural da Importina-alfa (ImpANc) é uma peça chave para o seu entendimento. Assim, esta proteína foi recentemente cristalizada e teve sua estrutura elucidada pelo nosso grupo de pesquisa. Experimentos biofísicos também já foram realizados por nós e mostraram que a proteína conserva algumas características presentes nas isoformas de Mus musculus e Saccharomyces cerevisiae que já tiveram suas estruturas cristalográficas elucidadas. Porém, a NcImpA apresenta aminoácidos não conservados próximos a região do domínio IBB, o que pode estar relacionado com a especificidade da proteína. Então, estamos propondo neste projeto: a) Expressão e purificação da proteína Importina-alfa de Neurospora crassa; b) quantificar a interação do peptídeos NLS da proteína hipotética NCU01629 (VPRPKRQQRRL) com a ImpANc por experimentos utilizando técnicas calorimétricas; c) cristalizar e elucidar a estrutura da Imp±Nc com o peptídeo (VPRPKRQQRRL) da região ligadora de proteína (região NLS) envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio.