Desenvolvimento e validação de metodologias para quantificação das gonadotrofinas, insulina e hormônio de crescimento na espécie bovina por elisa

• Processo: 16/13200-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2016
• Data de Término da vigência: 06 de maio de 2019
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
• Pesquisador responsável: Guilherme de Paula Nogueira
• Beneficiário: Marcos Antonio Maioli
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina Veterinária (FMVA). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araçatuba. Araçatuba , SP, Brasil
• Assunto(s): Validação
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: animais de produção | Hormônios glicoproteicos | Hormônios proteicos | Métodos imunoenzimáticos | validação | Ensaios imunoenzimáticos e endocrinologia

Resumo

Esta proposta possui dois enfoques principais, um consiste na padronização e completa validação de metodologias de ELISA de competição utilizando o sistema de amplificação biotina-estreptavidina, para quantificação de insulina, hormônio de crescimento, hormônio luteinizante e folículo estimulante para a espécie bovina. Outro objetivo será realizar a análise dos passos a serem adotados para as validações para de identificar padrões de ajustes que possam ser extrapolados para outros hormônios, dinamizando o processo de validação. Inicialmente a padronização consistirá na biotinilação dos hormônios, com posterior realização de testes de ligação bidimensionais para avaliar a melhor combinação de concentração entre anticorpo específico, anticorpo de captura e antígeno biotinilado, assim como os tempos e temperatura de incubação. Posteriormente serão realizados os testes para estabelecimento dos protocolos dos ensaios seguido pelos testes de quantificação de amostras. Após a padronização serão realizados os testes de validação que consistirão em avaliação da exatidão, precisão, sensibilidade, limite de quantificação inferior e linearidade. Ainda, por tratar-se de um projeto com múltiplas validações serão realizados estudos sobre a quantidade de antígeno marcado que deve ser utilizado por poço em mol (não em massa) e a possível relação com o peso molecular, a quantidade de anticorpo de captura necessária por cm2, a associação entre a porcentagem de ligação entre os padrões e seu efeito sobre a amplitude da curva padrão e os efeitos sobre a sensibilidade e limites de quantificação. Foi possível observar uma possível relação entre a diluição dos reagentes em ensaios imunoenzimáticos adaptados anteriormente que justifica a presente proposta (processo FAPESP 2014/09135-9). Por fim, serão realizadas imunizações para produção de anticorpos específicos contra insulina bovina em coelhos, além avaliação da potencial utilização do leite coletado de animais imunizados como fonte de anticorpos.