Identificação de alvos transcricionais diretos de PIF (fatores de interação a fitocromos) na via de biossíntese de tocoferol

• Processo: 16/24054-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2017
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2017
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Botânica
• Pesquisador responsável: Maria Magdalena Rossi
• Beneficiário: Daniele Silva Pereira Rosado
• Supervisor: Manuel Rodríguez-Concepción
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Center for Research in Agricultural Genomics (CRAG), Espanha
• Vinculado à bolsa: 15/14658-3 - Caracterização funcional das proteínas PIF (Phytochrome-Interacting Factor) de Solanum lycopersicum, BP.DD
• Assunto(s): Genética molecular vegetal Tocoferóis Tomate
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: ChIP-qPCR | phytochrome-interacting factors | Tocopherol | Tomato | transcription factor-promoter interaction | Transcriptional regulation | Genética Molecular de Plantas

Resumo

Frutos de tomateiro são fonte de substâncias nutracêuticas antioxidantes, como ácido ascórbico, carotenoides e tocoferóis (Vitamina E, VTE). A acumulação desses compostos plastidiais é influenciada pela luz, já que este sinal tem forte influência sobre a manutenção e atividade dos cloroplastos. Por exemplo, o silenciamento do regulador negativo DEETIOLATED 1 resulta em maiores frutos verdes com mais cloroplastos e clorofila (Chl), e maior acúmulo de carotenoides e VTE no fruto maduro. Por outro lado, o silenciamento do fator de transcrição (TF) HYPOCOTYL ELONGATED 5 (HY5), um indutor da fotomorfogênese, resulta em frutos verdes com cloroplastos deficientes e frutos maduros com menos carotenoides. Em Arabidopsis, a diferenciação e a atividade plastidial são reguladas por uma complexa rede controlada pela luz. Os Fatores de Interação a Fitocromos (PIFs) são componentes centrais dessa cascata, controlando o desenvolvimento em resposta à luz ao longo de toda a vida da planta. PIFs são TFs responsáveis pela repressão da fotomorfogênese no escuro. Apesar de estudados há quase vinte anos em Arabidopsis, pouco se sabe sobre estas proteínas em outras espécies. Como parte de meu projeto de doutorado financiado pela FAPESP, identifiquei oito loci codificantes para PIF no genoma de tomateiro e descrevi a expressão de seis deles em diferentes tecidos em resposta a tratamentos de luz/escuro. Com base no perfil e abundância dos transcritos, escolhi quatro genes para caracterização mais aprofundada. Um deles, PIF1a, tem expressão regulada ao longo do amadurecimento. O grupo do Prof. Rodriguez-Concepción mostrou por imunoprecipitação de cromatina seguida de PCR quantitativa (ChIP-qPCR) que este gene regula diretamente por meio da interação com o promotor a expressão do gene que codifica a primeira enzima da rota biossintética de carotenoides, regulando o acúmulo deste composto em frutos. Nos últimos anos, nosso grupo tem estudado a biossíntese de VTE. Os tocoferóis são antioxidantes não-enzimáticos, lipossolúveis, que tem ação protetora contra os dados provocados por espécies reativas de oxigênio, preservando as membranas tilacóides e o fotossistema II, especialmente sob estresse luminoso. Nosso grupo demonstrou que a biossíntese de VTE é estreitamente relacionada ao metabolismo de Chl e carotenoides, e que a expressão de genes envolvidos nessa rota é regulado espaço-temporalmente de maneira coordenada. Foi visto que muitos dos genes co-regulados compartilham motivos cis-regulatórios, e portanto devem ser regulados pelos mesmos TFs. Buscando compreender melhor a relação entre luz e VTE, investigamos atualmente o papel da luz na biossíntese dessa substância. Vimos que frutos amadurecidos sob luz constante acumulam mais tocoferol e que diversos genes responsáveis pela biossíntese de VTE são diferencialmente expressos nessas condições, sugerindo que a luz regula o acúmulo de VTE transcricionalmente. Por meio de uma análise de novo, identificamos motivos cis-regulatórios exclusivos e compartilhados de PIF e HY5 nos promotores destes genes. A partir destes resultados, levantamos a hipótese de que são regulados pela luz por intermédio destes TFs. A presente proposta via investigar se genes da via de VTE são alvos diretos das PIF. Para isso, será utilizada a técnica de ChIP-qPCR desenvolvida no laboratório do Prof. Rodriguez-Concepción em Barcelona, na Espanha, para analisar interações promotor-TF após expressão transiente em frutos de tomate. Essa metodologia será muito enriquecedora para minha tese e para a linha de pesquisa atualmente desenvolvida em nosso laboratório. (AU)