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Mecanismos epididimários de regulação pós-transcricionais na varicocele: relação com infertilidade masculina

Processo: 17/02850-2
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 02 de outubro de 2017
Vigência (Término): 01 de outubro de 2018
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina
Pesquisador responsável:Ricardo Pimenta Bertolla
Beneficiário:Larissa Berloffa Belardin
Supervisor no Exterior: Robert Sullivan
Instituição-sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : Université Laval, Canadá  
Vinculado à bolsa:16/05487-3 - Regulação epididimária da fertilidade no homem, BP.DR
Assunto(s):Varicocele   MicroRNAs   Reprodução humana

Resumo

Como a varicocele altera o perfil proteômico no plasma seminal, faz-se necessário entender quais são os mecanismos intrínsecos de regulação proteica presentes no ambiente testicular e nos epidídimos. Um dos principais mecanismos pós-transcricionais para controlar a expressão proteica é dado pela ação de RNAs não codificantes, denominados microRNAs (miRNAs). Assim, nossas hipóteses são: (i) existem diferenças na composição de miRNAs de epidídimosos em homens com e sem varicocele e; (ii) o reparo cirúrgico varicocele (varicocelectomia) pode restaurar o perfil de miRNA em epididimosomas, levando à melhoria em funções epididimárias relacionadas ao espermatozoide. Portanto, o objetivo do presente estudo é identificar os miRNAs em epididimosomos de homens controle (sem varicocele), homens com varicocele e homens após varicocelectomia, coletados para o estudo de doutorado financiado pela FAPESP (processo 2016/05487-3).As amostras foram coletadas e armazenadas a -20°C no Centro de Pesquisas em Urologia (UNIFESP, São Paulo). Controles (n=30), varicocele (n=30) e pré e pós varicocelectomia (n=2O). Os epididimossomos serão separados do plasma seminal após ultracentrifugação. Após a quantificação total de proteínas, entre 240 e 410 ¼g de proteínas contendo epididimossomos serão submetidos à extração e purificação de miRNAs. Os miRNAs epididimosomais serão extraídos e purificados usando o isolamento miRNA mirVana TM. Todas as amostras que serão utilizadas nos grupos experimentais (controles, com varicocele e pré e pós varicocelectomia), serão rotuladas e hibridizadas separadamente em 12 miRNA microarrays. Para análise estatística será utilizado o software PAWS (SPSS) 18.0. Para os grupos controle, varicocele, pré e pós varicocelectomia será utilizado o teste T de Student quando houver distribuição normal dos dados ou Mann Whitney para dados não normais. A quantificação em PCR em tempo real de miRNAs expressos em epididimossomos será realizada para validar resultados da análise de microarray. O RT pulsado seguido de PCR quantitativo utilizando SYBR Green (Roche Diagnostics) será realizada. O PCR quantitativo será realizado em modelos transcritos inversos com LightCycler FastStart SYBR Green I (Roche Diagnostics) de acordo com as instruções do fabricante. Os sinais de fluorescência serão recolhidos continuamente a um comprimento de onda de 530 nm de 65°C a 95°C a 0,2°C por segundo. O RT e o PCR quantitativo serão realizadas em duplicata em cada amostra. Serão utilizados quatro pontos para traçar a curva padrão (amostras não diluídas e diluições padrão de 1:2, 1:4 e 1:8).

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