Capacitação em técnicas de cultura celular

• Processo: 20/15951-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de janeiro de 2021
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2021
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Farmacologia - Neuropsicofarmacologia
• Pesquisador responsável: Sabrina Francesca de Souza Lisboa
• Beneficiário: Egidi Mayara Firmino Silva
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 17/19731-6 - Identificação de mecanismos epigenéticos induzidos por estresse que modulam a sinalização endocanabinóide e a resposta neuroimunológica como novos alvos farmacológicos no tratamento do transtorno de estresse pós-traumático (PTSD), AP.JP
• Assunto(s): Cultura de células Exossomos Microglia Neurônios Neurofarmacologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: cultura celular | cultura de células primárias | Exossomos | microglia | neurônios | Neurofarmacologia

Resumo

O bolsista será responsável por obtenção e manutenção de culturas primárias de neurônios e células da glia a partir do cérebro de roedores e acompanhamento de experimentos relacionados. Será estabelecida uma rotina onde as tarefas serão distribuídas durante a semana. Inicialmente o bolsista receberá treinamento e capacitação inicial sobre as normas de biossegurança do laboratório, sobre o uso e manipulação de animais de experimentação, sobre boas práticas para cultivo celular e manutenção de ambiente adequado para tal. O bolsista será responsável por coletar os tecidos de embriões ou de animais recém-nascidos e obtenção de culturas primárias de neurônios ou células da glia. Será responsável pelo preparo das soluções, de meios de cultura e manutenção das culturas celulares de forma adequada até o momento do uso nos experimentos. O bolsista acompanhará os alunos durante os experimentos para garantir a excelência da condução destes. Fará parte das tarefas de rotina sua participação nas discussões científicas do laboratório.Metodologia a ser empregada: 1.Cultura primária de micróglia: será obtida do encéfalo total de camundongos machos recém-nascidos (PN1) (WT, TRPV1 KO, P2XR7 KO, NLRP3 KO) de forma asséptica. Após dissociação dos tecidos e várias etapas, as células serão coletadas, centrifugadas, a viabilidade será avaliada e as células serão adicionadas em placas e posteriormente incubadas com meio contendo os tratamentos a serem investigados. Após tempos determinados para cada estímulo, o meio coletado será centrifugado e submetido a isolamento de vesículas extracelulares (VEs) utilizando kit comercial Total Exosome Isolation (Invitrogen, Thermo). O material obtido será ressuspendido em PBS1x e usado para análise de tamanho e concentração de partículas (Análise de rastreamento de nanopartículas, NanosightNS300 com câmera acoplada; Laboratório Multiusuário de Caracterização de Micro e Nanopartículas, FCFRP/USP). Proteínas e RNA serão isolados para verificar a pureza dos exossomos por Western blotting e níveis dos RNAm de interesse por qPCR. Parte dos exossomos será congelado à -80oC para extração de lipídeos pelo método clorofórmio:etanol (2:1, v/v) e detecção dos níveis de ECBs (AEA e 2-AG) por cromatografia líquida acoplada à espectrofotômetro de massa (LC/MS; CEQIL (Centro de Excelência para quantificação e identificação de lipídeos, FCFRP/USP). 2. Cultura primária de neurônios: os cérebros de embriões de camundongos com 14 dias serão retirados de forma asséptica. O bulbo olfatório será removido e os hemisférios cerebrais separados. O hipocampo será isolado de cada metade do hemisfério, na porção medial do córtex. O restante será utilizado para a cultura cortical. Após digestão enzimática dos tecidos com tripsina e várias etapas, será feita a contagem de células e 5x105 células/cm2 serão colocadas em placas revestidas com poli-l-lisina e laminina e mantidas em meio suplementado (NB, 2% B27; 1% l-glutamina). Para verificar o efeito das VEs liberadas pela micróglia estimulada, culturas de neurônios serão incubadas com as VEs ou meio de cultura. Após o período de incubação, as células serão lavadas, os neurônios coletados e processados para obtenção de sinaptoneurossomas por sucessivas filtrações e centrifugações. Eles serão homogeneizados em tampão RIPA para extração proteica e realização dos ensaios de Western blotting. Grupos independentes de culturas de neurônios serão fixados em PFA 2% e será realizada imuno-histoquímica.