Avaliação genômica da ocorrência de eventos off-targets e cópias de PERVs em células de suínas geneticamente modificadas para xenotransplante

• Processo: 22/11022-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2022
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2022
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunogenética
• Pesquisador responsável: Jorge Elias Kalil Filho
• Beneficiário: Gerlandia Neres Pontes
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina (FM). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/11872-5 - Centro de Ciência para o Desenvolvimento em Xenotransplante, AP.CCD
• Assunto(s): Sequenciamento de nova geração
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: CRISPR-Cas | Next Generation Sequencing | Off-target events | PERVs | swine cells | Xenotransplantation | Xenotransplante

Resumo

A edição gênica com o sistema CRISPR-Cas9 possui potencial risco de surgimento de mutações off-target que podem ser resultantes da baixa especificidade do gRNA. Os efeitos de tais mutações podem variar desde a alteração da função de genes importantes até grandes indels cromossômicos que podem resultar em instabilidade genômica, dificultando sua translação direta para a rotina clínica. Diante dos possíveis efeitos colaterais das edições realizadas no genoma suíno para criação de um modelo viável para xenotransplante, faz-se necessária uma análise genômica aprofundada a fim de rastrear loci com variantes off-target. Assim, compondo importante pilar para o projeto, está a proposta de análise genômica do genoma suíno modificado (TKO.PERVKO.7TG: triplo nocaute, livres de PERV e transgênicos). Será realizado o rastreio de mutações off-target, acompanhado da predição computacional do impacto funcional dessas variantes. Para atingir esses fins, será necessária a realização de deep sequencing dos loci com maiores chances de ocorrência de off-targets, segundo predições in silico, em suínos produzidos em nosso laboratório. Adicionalmente, para avaliar a eficiência de inativação dos PERVs, nós propomos: 1) Genotipagem das células transfectadas, tendo as respectivas células selvagens como referência; 2) Sequenciamento de nova geração (deep sequencing) do gene pol; 3) Quantificação da atividade da transcriptase reversa dos PERVs. A mesma quantificação também será realizada em tecidos oriundos de rim, pele, córnea e coração de animais gerados pela técnica de Transferência Nuclear de Células Somáticas (SCNT), para avaliação do risco de reinfecção e potencial mosaicismo. Dessa forma, verificados todos os efeitos das edições realizadas no genoma suíno, espera-se estabelecer um pipeline seguro para a produção desses animais para posterior uso clínico.