Análise de possíveis genes modificadores de fenótipo da distrofia muscular

• Processo: 22/14129-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2022
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2024
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Animal
• Pesquisador responsável: Mayana Zatz
• Beneficiário: Tatiana Jazedje da Costa Silva
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/08028-1 - CEGH-CEL - Centro de Estudos do Genoma Humano e de Células-Tronco, AP.CEPID
• Assunto(s): Distrofia muscular Genes
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Distrofia Muscular | gene | genética | Gwas, Rt-Pcr, Wb

Resumo

Cães GRMD (do inglês, Golden Retriever Muscular Dystrophy), são um excelente modelo de estudo da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) que afeta seres humanos. Estes apresentam uma mutação de ponto no final do íntron 6 do gene da distrofina, gerando um códon de parada no início do éxon 7. Portanto, os cães afetados possuem ausência completa da proteína distrofina em seus músculos esqueléticos, o que causa um quadro clínico degenerativo progressivo e muito grave, semelhante ao que ocorre nos pacientes com DMD. Em 2015, nosso grupo publicou um importante artigo mostrando fortes evidências de que o aumento da expressão do gene Jagged1, um conhecido regulador da via do Notch, possivelmente era o fator responsável pelo fenótipo distrófico leve de 2 cães do nosso canil experimental. Denominamos estes cães benignos de escapers. Outras análises funcionais demonstraram que a super-expressão de Jagged1 melhora o fenótipo de peixes zebrafish distróficos, reforçando nossa hipótese. Análises de microarray também revelaram expressão reduzida da proteína de transferência de fosfatidilinositol-± (PITPNA) em cães escapers, quando comparados a cães severamente afetados. Nos cães escapers, a expressão diminuída de PITPNA foi associada ao aumento da expressão de Akt fosforilado (pAkt) e diminuição dos níveis de PTEN, sugerindo PIPTNA como um modificador da doença que confere benefícios à sinalização, morfologia e função anormais do músculo esquelético. O peixe zebrafish sapje knockdown para PITPNA também resgatou o fenótipo muscular anormal e melhorou a sobrevivência do mutante sapje a longo prazo. Desde então, Jagged1 e PITPNA têm sido estudados por diversos grupos de pesquisa como genes modificadores da distrofia muscular, especialmente em cães distróficos. Atualmente, nosso canil experimental abriga 2 novos cães distróficos benignos portadores da mesma mutação e ausência da proteina muscular distrofina. Supreendentemente, estes novos cães não apresentam a variante no gene Jagged1 observada nos cães benignos anteriores. Além disso, pela primeira vez em nosso canil, temos cães benignos e afetados graves com mesma idade, nascidos da mesma ninhada e mantidos pelos profissionais com muita experiência no manejo clínico. O nascimento destes cães nos dá novas perspectivas de estudos genômicos, pois agora temos DNA de 4 cães escapers (dentre os mais de 200 indivíduos nascidos) e fortes evidências de que apenas a presença da variante encontrada anteriormente no gene Jagged1 não justifica, sozinha, o fenótipo benigno destes cães. Há um longo caminho a ser trilhado. Sendo assim, os objetivos vinculados a esta bolsa TT-5 são: (1) resgatar amostras importantes de DNA do canil GRMD Brasil, em especial de cães distróficos benignos e severamente afetados; (2) selecionar amostras de DNA para estudos de associação fenótipo-genótipo (GWAS - do inglês, Genome Wide Association Studies); (3) Coletar RNA e proteínas totais de músculos de cães benignos e severamente afetados para estudos de diversas proteínas. (4) Avaliar a expressão de vários genes de interesse pelo nosso grupo de pesquisa através de RT-PCR (Real time Polimerase Chain Reaction), sendo eles: LAMA1, JAG1, PTEN, PITPNA, HES2 e SLC6A12; (5) Avaliar ausência/presença e quantidade de proteínas musculares por Western Blot (WB); (6) validar os possíveis achados com a análise do genoma completo dos cães benignos versus cães severamente afetados.