RuvB-like 1: essencialidade e função em Leishmania braziliensis

• Processo: 23/14086-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de janeiro de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Angela Kaysel Cruz
• Beneficiário: Fernanda Hergert Voigt
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/14398-0 - Centro Reino-Unido-Brasil para o Estudo da Leishmaniose (JCPiL), AP.TEM
• Assunto(s): Genética reversa Leishmania Parasitologia molecular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: DiCre | Função Gênica | genética reversa | leishmania | RuvB | Parasitologia Molecular

Resumo

As Leishmanioses são causadas pelos parasitas tripanossomatídeos do gênero Leishmania e representam uma questão de saúde pública global. Estes parasitos possuem particularidades quanto à organização genética e regulação de expressão gênica: seus genes estão arranjados em unidades policistrônicas sem promotores específicos e os transcritos passam pelo processo de trans-splicing para dar origem a mRNAs maduros, concentrando portanto seu controle da expressão gênica em nível pós-transcricional. Esse controle pode ser feito por proteínas ligantes de mRNA, conhecidas como RBPs (RNA Binding Proteins), que podem ser afetadas por modificações pós-traducionais (PTM), como a metilação de argininas catalisada por enzimas PRMTs (proteínas metiltransferases de arginina), que alteram a afinidade das RBPs por seus substratos e parceiros de interação. Em projeto prévio desenvolvido no laboratório, a proteína RuvB-like 1 de L. braziliensis foi co-imunoprecipitada juntamente à LbrPRMT5, durante a busca pelas proteínas afetadas por PRMTs. A RuvB é uma helicase putativa possivelmente envolvida na reversão de danos na forquilha de replicação e durante a formação da estrutura de Holliday. Em nosso laboratório, a enzima LbrRuvB-like 1 foi etiquetada com myc na porção N-terminal e sua localização subcelular foi determinada. Inesperadamente, a enzima foi encontrada prioritariamente no citoplasma, aparentemente apresentando uma fração presente no núcleo de formas promastigotas; esta distribuição precisa ser reavaliada ao longo do ciclo celular. As tentativas de nocaute gênico para LbrRuvB-like 1 por CRISPR/Cas9 foram infrutíferas, assim, de forma a avaliar a essencialidade de LbrRuvB-like 1 e sua funcionalidade, utilizaremos uma estratégia de nocaute induzível por meio de DiCre (Dimerised Cre recombinase), com posteriores análises celulares do efeito do desligamento desse gene pela definição da taxa de crescimento e pela taxa de fosforilação da histona c-H2A, e de seu envolvimento na resistência ao estresse genotóxico pelo método de MTT. Além disso, metodologias como imunofluorescência e western blot serão empregadas para definir a localização subcelular de LbrRuvB-like 1 durante as fases do ciclo de vida do parasito.