Clonagem, expressão e purificação das proteínas fosfatases mitocondriais

• Processo: 24/03196-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Luciana Elena de Souza Fraga Machado
• Beneficiário: Carla Jordânia da Silva Oliveira
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 19/02605-3 - Modulação estrutural e funcional das proteínas fosfatases mitocondriais pelo metabolismo redox e as implicações na biologia celular, AP.JP
• Assunto(s): Clonagem Expressão de proteínas Purificação de proteínas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: clonagem | Dusps | Expressão de proteínas | Funcao de proteinas | Proteína fosfatase | Purificação de Proteínas | Biologia molecular e bioquímica de proteínas

Resumo

A clonagem molecular e a expressão heteróloga de proteínas são etapas extremamente importantes para o estudo da função de proteínas, identificação de interação com outros ligantes, como moléculas, fármacos e proteínas. Para o estudo da regulação redox das proteínas fosfatases mitocondriais, a investigação das suas interações, a determinação das suas estruturas e as análises de dinâmica estrutural, é necessário um alto rendimento na expressão destas enzimas. As técnicas utilizadas para as análises propostas neste projeto compreendem a calorimetria de titulação isotérmica, a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e a Cristalografia de raios-X, metodologias que demandam grande quantidade de proteínas e que portanto elevam substancialmente o custo de produção das proteínas de interesse. No entanto, diversos grupos vem trabalhando para minimizar os custos da expressão heteróloga de proteínas em altas quantidades e com marcação específica para as análises por RMN1,2. Sendo assim, o objetivo deste projeto é realizar a clonagem, a expressão das proteínas fosfatases mitocondriais, utilizando o organismo celular bacteriano E. coli e a purificação solúvel destas enzimas nas suas formas monoméricas e ativas. A clonagem das proteínas fosfatases mitocondriais (PP2Cm, PPTc7 e PTPMT1/DUSP23) foram realizadas nos vetores pETRP1B, pTHGT, pTHMT ou pETRP1B SUMO. Estes vetores contem um tag de 6 histidinas (pETRP1B) acoplados ao tag de glutationa (pTHGT) ou de proteína ligante de maltose (pTHMT) ou a proteína sumo (pETRP1B SUMO) e um sítio de clivagem para TEV (Tobacco Etch Virus) e são bem estabelecidos para o estudo de proteínas fosfatases citoplasmáticas. Entretanto, devido a eficiência parcial de clivagem dos tags de proteínas solúveis apresentadas no relatório enviado, e com o objetivo de otimizar ainda mais o rendimento das proteínas PP2Cm4 e PPTc7, pretendemos utilizar o protocolo bem estabelecido utilizado para a proteína fosfatase PP1 (co-expressão com chaperonas GroEL/ES)3. Para as outras DUSPs (DUSP26, DUSP21, DUSP18) mitocondriais pretendemos inserir no vetor pETRP1B-SUMO uma vez que tivemos sucesso e bons rendimentos para a DUSP23 (relatório do aluno Luca submetido). Como resultado deste projeto, espera-se a produção de proteínas fosfatases mitocondriais solúveis, bem enoveladas e ativas para a realização de todos os experimentos propostos neste projeto, incluindo os projetos de iniciação científica e de mestrado.