CONSTRUÇÃO DE "ARTILISINAS" PARA O CONTROLE DE Xanthomonas citri subsp. citri

• Processo: 23/08535-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Agronomia - Fitossanidade
• Pesquisador responsável: Henrique Ferreira
• Beneficiário: Igor Vinicius Ramos Otero
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Rio Claro. Rio Claro , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/10577-0 - Centro de Pesquisa em Biologia de Bactérias e Bacteriófagos (CEPID B3), AP.CEPID
• Assunto(s): Bacteriófagos Biologia sintética Cancro (doença de planta) Fitopatologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Bacteriófagos | Biologia Sintetica | Cancro cítrico | endolisina | Fitopatologia

Resumo

A bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) é o agente etiológico do Cancro Cítrico Asiático (ACC), principal doença bacterina que afeta o cultivo de citros no Brasil e no mundo. A atual estratégia de aplicação de compostos cúpricos no campo para evitar o espalhamento de X. citri, têm despertado preocupações quanto ao impacto ambiental e a possível indução de resistência ao cobre nessas bactérias. Dentre as alternativas ao uso do cobre, destaca-se a utilização de bacteriófagos (fagos) e/ou suas enzimas capazes de controlar o crescimento de X. citri. Endolisinas são hidrolases derivadas de fagos, capazes de lisar eficientemente o peptidoglicano de bactérias Gram-positivas. Contudo, essas enzimas apresentam baixa eficiência sobre bactérias Gram-negativas. Artilisinas são endolisinas modificadas, expressas associadas a peptídeos capazes de desestabilizar ou destruir a membrana externa de bactérias Gram-negativas. A destruição ou desestabilização da membrana externa das bactérias Gram-negativas possibilita que a enzima modificada chegue ao peptidoglicano e consequentemente lise a parede celular dessas bactérias. Dessa forma, o presente projeto tem como objetivo a obtenção de uma artilisina capaz de desestabilizar ou destruir a membrana externa de X. citri, degradar a parede celular bacteriana desse organismo e atuar como agente antimicrobiano protetivo contra o cancro cítrico. Para tal propósito, serão analisadas a associação de cinco endolisinas com três peptídeos policatiônicos. A ação antimicrobiana das artilisinas será avaliada em ensaios in vitro e in vivo. Inicialmente, quatro endolisinas serão selecionadas a partir de fagos infectantes de X. citri, provenientes da biblioteca de bacteriófagos do Laboratório de Genética de Bactérias (LGB - IB/RC). Uma quinta endolisina será selecionada a partir de trabalhos previamente publicados e será utilizada como controle. Três peptídeos policatiônicos serão selecionados e/ou modificados a partir de trabalhos previamente publicados. Será criado um sistema modular de expressão baseado na tecnologia de Golden gate assembly visando a obtenção de diferentes combinações entre as endolisinas e peptídeos policatiônicos selecionados. O presente projeto prevê a criação de 14 novas artilisinas e a obtenção de uma enzima com atividade já comprovada contra bactérias Gram-negativas. Todas as 15 artilisinas serão produzidas por expressão heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) ou Pichia pastoris KM71 e purificadas por cromatografia de afinidade. Todas as enzimas serão caraterizadas quanto a atividade muralítica em X. citri. Enzimas com atividade muralítica comprovada serão caracterizadas quanto a temperatura e pH ótimo de atividade. Após essa etapa, será realizada a avaliação da redução logarítmica de crescimento frente a três isolados de X. citri, visando a seleção da artilisina com melhor atividade antimicrobiana. A partir dessa seleção, será definida a concentração inibitória para a artilisina com melhor atividade, bem como sua estabilidade em função do pH e da temperatura. A atividade contra X. citri em biofilme também será determinada. Por fim, a ação in vivo será avaliada pelo potencial protetivo da artilisina contra infecção por X. citri nas folhas de Citrus sinensis (laranja doce). Os resultados do presente projeto contribuirão para o desenvolvimento de novas formas de controle de X. citri e possível controle do ACC. Como parte do CEPID B3, as artilisinas criadas poderão ser empregadas no controle de outras bactérias relevantes. Por fim, o sistema modular de expressão proposto poderá ainda ser utilizado em futuras etapas de otimização e ou criação de novas artilisinas.