Estudo da regulação da expressão da aconitase e efeitos de sua ligação ao degradossomo de rna em caulobacter crescentus

• Processo: 24/09014-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Marilis Do Valle Marques
• Beneficiário: João Pedro de Carvalho Pereira
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/10577-0 - Centro de Pesquisa em Biologia de Bactérias e Bacteriófagos (CEPID B3), AP.CEPID
• Assunto(s): Caulobacter RNA Regulação da expressão gênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Aconitase | Caulobacter | Regulação pós-transcricional | Rna | Regulação gênica

Resumo

A aconitase é uma enzima que participa do Ciclo de Krebs, catalisando a conversão reversível de citrato para isocitrato. Ademais, em muitos outros organismos de grupos diversos essa proteína, além de sua função enzimática, também apresenta uma função regulatória, ligando alguns RNAs mensageiros e interferindo na sua estabilidade e tradução. Em Caulobacter crescentus, tudo indica que a aconitase também possui essa função regulatória, porém, neste organismo, ela se encontra associada a um complexo proteico denominado degradossomo de RNA, que em procariontes realiza o turnover dos RNAs. Estudos prévios mostraram que o desligamento da aconitase do degradossomo gera mudanças na quantidade de aconitase celular e na estabilidade de seu RNA mensageiro. Este projeto pretende avaliar os impactos que a ligação do degradossomo gera na função regulatória da aconitase e compreender a sua regulação transcricional e pós-transcricional em Caulobacter crescentus. Para caracterizar a regulação da expressão, serão construídas fusões transcricionais e traducionais da sua região regulatória com o gene repórter lacZ, respectivamente, nos vetores placZ290 e pJBZ281 e serão realizados ensaios de Beta-galactosidase em diversas condições. Para avaliar os impactos da sua ligação ao degradossomo, será utilizada uma linhagem na qual o sítio de ligação da aconitase no degradossomo foi retirado (DeltaAcnBS). Utilizaremos uma linhagem na qual códons para um tag FLAG foram adicionados ao início da ORF da aconitase, para permitir a purificação da proteína com os RNAs ligantes e sequenciamento destes por meio de RNA-seq (HITS-CLIP). Após a identificação, faremos uma análise da sua estabilidade por meio de qRT-PCR nas linhagens selvagem e DeltaAcnBS.