Otimização de transdução de macrófagos por vetor lentiviral

• Processo: 25/24990-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2025
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia
• Pesquisador responsável: Bruna Cunha Gondim de Alencar
• Beneficiário: Jhonnatan Olivetti Klarosk
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 25/13226-4 - Otimização de transdução de macrófagos por vetor lentiviral, AP.R
• Assunto(s): Macrófagos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Macrófagos | silenciamento | Transdução | Vetor lentiviral | Biologia Celular de células imunológicas

Resumo

A transdução de macrófagos humanos por vetor lentiviral, embora ofereça um poderoso recurso para knockdown gênico, enfrenta diversos desafios que impactam diretamente a execução laboratorial. A carência de detalhes metodológicos em trabalhos científicos leva à dificuldade de reprodução dos protocolos existentes. O laboratório que sedia o projeto vigente tem encontrado dificuldades na manipulação genética de macrófagos, fator que impede o uso desse tipo celular em estudos que necessitem manipulações como o silenciamento gênico.O objetivo geral deste trabalho é determinar um protocolo otimizado e com altas taxas de sucesso para a transdução por vetor lentiviral derivado de HIV-1 em macrófagos derivados de monócitos primários humanos. Os objetivos específicos são: testar métodos de diferenciação celular com diferentes meios de cultivo (meio RPMI com FBS ou soro humano AB, e com ou sem M-CSF); avaliar técnicas de transdução durante a diferenciação (com vírus fresco ou congelado); testar diferentes técnicas de otimização de transdução lentiviral (modulação da porcentagem de soro (2), superexpressão de CD47 na célula empacotadora e vetor lentiviral (3), inoculação em centrífuga (espinoculação) (4), utilização de retronectina (5) ou protamina (6), pseudotipagem com glicoproteína de vírus endógeno de babuínos - BaEV (7)); por fim, silenciar o gene MYO9B para validar o uso do protocolo para o silenciamento gênico. Para atingir os objetivos propostos, serão utilizadas técnicas de análise. São elas: morfologia celular por microscopia óptica; viabilidade celular por corante azul de tripan e/ou live/dead; sucesso de diferenciação por citometria de fluxo para marcadores de macrófagos; porcentagem de transdução com e sem antibiótico; e sucesso do silenciamento por qPCR e Western Blot.