Genômica funcional de genes envolvidos na fotossíntese da cana-de-açúcar: Desenvolvimento de métodos de transformação nuclear e de plastídeos em cana-de-açúcar

• Processo: 09/13662-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2009
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2012
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Helaine Carrer
• Beneficiário: Daniel Alves Ramiro
• Instituição Sede: Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ). Universidade de São Paulo (USP). Piracicaba , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 08/52066-7 - Functional genomics of photosynthetic genes in sugarcane, AP.BIOEN.TEM
• Assunto(s): Biotecnologia de plantas Transformação genética Expressão gênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: expressão gênica | peptídeo de transito | rubisco | transformação genética | Biotecnologia de plantas

Resumo

A transformação genética de plantas cultivadas possibilita a validação funcional de genes individuais selecionados, bem como a exploração direta dos transgênicos no melhoramento genético visando a inserção de características agronômicas desejáveis. Na maioria das culturas estudadas, a técnica de transformação nuclear é frequentemente utilizada para a pesquisa fundamental e na exploração comercial de derivados biotecnológicos. Duas estratégias principais de transformação são utilizadas em monocotiledôneas: transformação mediada por micro-projétil (biolística) e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Em cana-de-açúcar estas técnicas foram realizadas com sucesso. Embora uma maior eficiência de transformação seja observada na técnica de bombardeamento com micro-projéteis, a transformação mediada por Agrobacterium tem se tornando o veículo preferencial para a inserção de genes em cana-de-açúcar. Esta constatação surge essencialmente das vantagens encontradas no processo T-DNA de transferência de genes, entre as quais a alta proporção de eventos de inserção simples apresentando transgenes intactos, expressão estável e herdabilidade. Neste projeto, um sistema de transformação nuclear mediado por Agrobacterium será desenvolvido. Em adição, este projeto se propõe a desenvolver metodologias de transformação plastidial em cana-de-açúcar. Esta técnica oferece um grande número de vantagens sobre a transformação nuclear, entre as quais um alto nível de expressão dos transgenes, a possibilidade de construções multigênicas, a restrição na dispersão do transgene (fluxo gênico), e a ausência de efeitos de posição e silenciamento dos transgenes. Recentemente, tem sido demonstrado que o aumento na eficiência fotossintética de plantas resulta em maior produção e produtividade. Uma enzima chave neste processo é a Rubisco. Entretanto, devido ao grande número de copias presentes no núcleo, o desenvolvimento de uma abordagem apropriada para a construção de subunidades S (RbcS) em plantas superiores continua sendo um desafio. Essencialmente, em função desta dificuldade este projeto irá direcionar a manipulação da subunidade L (RbcL) plastidial da Rubisco. Paralelamente à Rubisco, nosso foco de estudo também será ampliado à outras enzimas importantes no ciclo de fixação de CO2 (PEPC e Anidrase Carbônica) bem como as enzimas dos fotossistemas I e II, as quais serão selecionadas pela técnica de micro-arranjos durante o Programa BIOEN. O objetivo geral deste projeto é o desenvolvimento de tecnologias de transformação genética visando aumento da eficiência fotossintética em cana-de-açúcar. Os objetivos específicos são: 1) clonagem de genes fotossintéticos como anidrase carbônica e PEP carboxilase de cana-de-açúcar em vetores de transformação nuclear para a expressão em cana-de-açúcar; 2) preparação de vetores para transformação plastidial utilizando a recombinação homóloga para a expressão de genes marcadores seletivos de resistência a antibióticos como canamicina, estreptomicina e outros; 3) desenvolvimento de um protocolo de transformação nuclear da cana-de-açúcar por Agrobacterium; 4) desenvolvimento da transformação plastidial da cana-de-açúcar por biolística; 5) seleção de plantas transformadas via PCR e análises bioquímicas.