Desenvolvimento através de evolução dirigida de beta-glicosidases com alta atividade e especificidade por celobiose

• Processo: 09/13848-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2009
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2011
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
• Acordo de Cooperação: CNPq - Pronex
• Pesquisador responsável: Sandro Roberto Marana
• Beneficiário: Roberto Rozenberg
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 08/55914-9 - (bioen/pronex FAPESP) Development of beta-glycosidases designed to improve the efficiency of noncomplexed cellulase systems, AP.BIOEN.TEM
• Assunto(s): beta-Glicosidases Spodoptera
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: beta-glicosidases | Evolução dirigida | evolução dirigida

Resumo

A beta-glicosidase digestiva da lagarta Spodoptera frugiperda (Sfbgli), uma enzima naturalmente ativa sobre celobiose, será submetida a evolução dirigida para seleção de mutantes com atividade e especificidade aumentadas por este dissacarídeo. Para isso, um plasmídeo que codifica Sfbgli será submetido à mutagênese aleatória in vivo usando bactérias XL1-Red ou alternativamente usando o kit Genemorph. A seguir esta biblioteca de mutantes será varrida utilizando a razão de atividade sobre celobiose/p-nitrofenilbglucosídeo para identificação dos mutantes desejados. Para isso, a biblioteca de plasmídeos mutantes será introduzida em bactérias BL21DE3 que serão induzidas a produzirem Sfbgli. O crescimento das bactérias, indução da expressão e ensaios de atividade enzimática serão feitos em placas de 96 poços. A partir das colônias que expressam os mutantes selecionados será feita extração de plasmídeos para sequenciamento e identificação da mutação. Estes plasmídeos poderão servir como ponto de partida para novos ciclos de mutagênese e seleção, culminando com uma Sfbgli mutante apresentando atividade e especificidade por celobiose ampliadas em relação a forma selvagem. Além disso, como resultado também espera-se a localização de resíduos externos ao sítio ativo que estejam envolvidos na modulação da atividade especificidade em beta-glicosidases. (AU)