Clonagem e sequenciamento da endooligopeptidase a (outrora ec 3.4.22.19).

• Processo: 97/07397-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 1997
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2000
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Mirian Akemi Furuie Hayashi
• Beneficiário: Mirian Akemi Furuie Hayashi
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 95/02850-1 - Processamento proteolítico de peptídeos bioativos e toxinas, AP.TEM
• Assunto(s): Neuropeptídeos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Endooligopeptidase | Metalo-Proteases | Neuropeptideos

Resumo

A metalo-endooligopeptidase recombinante de testículo de rato (EC 3.4.24.15 ou rEOP 24.15) e a endo-oligopeptidase A de cérebro de coelho (EOPA ou EC 3.4.22.19), outrora classificada como tiol protease, foram comparadas, lado a lado, quanto às suas propriedades físico-químicas mais marcantes e quanto à sua especificidade por oligopeptideos. Em relação à distribuição tecidual em ratos e coelhos, não foi possível estabelecer nenhuma correlação entre os níveis de atividade enzimática no citosol e os níveis de RNA mensageiro codificante para a metalo- endooligopeptidase 24.15 (EOP 24.15). Os resultados sugerem que a atividade de metabolização de neuropeptídios predominante no citosol, atribuída à metalo-endooligopeptidase 24.15 (EOP 24.15), deva provavelmente ser devido à atividade de pelo menos duas enzimas citosólicas distintas, sendo uma predominante no testículo de ratos (EOP 24.15) e a outra no cérebro e testículo de coelho, e possivelmente, no cérebro de rato também (EOPA). Visando a determinação da seqüência primária da EOPA, o cDNA de uma biblioteca de cérebro de coelho (ER-12), identificado através da seleção com anticorpo policlonal mono-específico anti-EOPA, foi clonado e seqüenciado. A seqüência primária deduzida deste cDNA apresenta o "motif' típico das metalo-proteases [HEXXH], sem ter contudo, homologia significativa com proteases ou oligopeptidases conhecidas, incluindo a EOP 24.15. Por outro lado, foi observado um alto grau de homologia (~ 88% da seqüência num segmento de aproximadamente 400 pb) com a região rica em cisteínas, aparentemente envolvida na ligação de citocinas, presente na proteína "hevin", e que parece exercer um papel importante na facilitação da migração dos linfócitos (Springer e cols., 1995). Ainda não foi possível expressar a proteína recombinante íntegra para que a atividade específica característica da endooligopeptidase A de cérebro de coelho fosse verificada, porém ensaios imunológicos realizados com anticorpos produzidos contra a proteína recombinante parcial e a distribuição do RNA mensageiro correspondente nos diversos tecidos do coelho sugerem que o cDNA em questão codifica para a endooligopeptidase A, responsável pela atividade de metabolismo de neuropeptídios no citosol de cérebro de coelho. A obtenção do cDNA completo correspondente ao clone ER-12 permitirá a expressão da proteína íntegra e através da demonstração da sua atividade catalítica, será possível estabelecer de forma conclusiva a sua relação com a atividade EOPA do sistema nervoso central do coelho. Em outras palavras, somente com a detecção da atividade EOPA-símile da proteína recombinante será possível garantir de forma irrefutável a existência de uma enzima com seqüência primária diferente da EOP 24.15, capaz de atuar nos mesmos neuropeptídios, apresentando, ainda, uma distribuição tissular diferente. (AU)