Estudos do mecanismo de ativação alostérica do TRP repressor através da comparação das estruturas em solucao,obtidas pela técnica de NMR do repressor e seus mutantes e dos respectivos complexos com l-trip..

• Processo: 93/04719-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Pesquisa
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 1994
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 1996
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Tais Helena Schmitt
• Beneficiário: Tais Helena Schmitt
• Pesquisador Anfitrião: Oleg Jardetzky
• Instituição Sede: Pessoa Física
• Instituição Anfitriã: Stanford University, Estados Unidos
• Assunto(s): Estrutura molecular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Dinamica Molecular | Estrutura Molecular | Negulacao Aloiterica | Nmr | Proteinas E Acidos Nucleicos | Trp Repressor

Resumo

O mecanismo de regulação alostérica do trp Repressor será estudado examinando-se a estrutura em solução dos apo- e holo-repressores e do complexo holo-repressor com o trp Operon, em comparação com as estruturas de repressores mutantes e seus respectivos complexos. As estruturas em solução do apo- e holo-repressor nativo, bem como do complexo do holo-repressor com DNA foram determinadas em solução por técnicas avançadas de NMR (Arrowsmith e cols., Eur. J. Biochem. (1991) 202. 53; Zhao e cols., J. Mol. Biol. (1993) 229, 735; Zhang e cols., submetido). As estruturas dos repressores mutantes nas formas apo- e holo- e de seus complexos com DNA serão obtidas por técnicas semelhantes. O fragmento de DNA a ser utilizado possui a seguinte seqüência: 5'-CGTAC TAGTT-AACTAGTACG-3'. Esta seqüência corresponde à seqüência natural do operador frp-EDCBA, exceto pela substituição do par de bases na posição 3 (A por T) para torná-lo perfeitamente palindrômico. Os mutantes serão fornecidos pelo Dr. P. Youderian, do California Institute of Biological Research. Uma seleção prévia dos mutantes será realizada para verificar quais mutantes apresentam modificações estruturais significativas que mereçam análise minuciosa de estrutura. A seleção será feita após a obtenção de padrões de COSY e NOESY dos mutantes nas formas apo- e holo-, espectros de análogos marcados com 13N, e NOESY completo do complexo holo-repressor-DNA. Concomitantemente à obtenção dos dados experimentais, será realizado um estudo de dinâmica molecular dos mutantes por modelagem molecular. Uma vez selecionados os mutantes de interesse, estes terão sua estrutura determinada em detalhe. Para tanto, será necessário parcial ou total re-atribuição de ressonâncias dos espectros COSY e NOESY, recálculo da estrutura utilizando um novo conjunto de restrições, e re-examinação da dinâmica molecular em diferentes regiões da proteína. Neste estágio, serão utilizadas técnicas tridimensionais com edição espectral isotópica dupla de 2H-15N e 15N-l3C. Os resultados obtidos serão analisados à luz de hipóteses propostas para o mecanismo de regulação alostérica do trp Repressor. (AU)