Caracterização funcional de mutantes de triptofano da Ca2+ATPase

• Processo: 02/02138-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2002
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2005
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Sergio Verjovski Almeida
• Beneficiário: Ana Claudia Oliveira Carreira Nishiyama
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Ca2+Atpase | Reticulo Sarcoplasmatico

Resumo

Mutantes da 6xHis Ca2+ATPase de retículo sarcoplasmático de coelho com substituições em cada um treze resíduos triptofanilos, gerados por mutagênese sítio-dirigida (Reis, 2000), serão expressos em um sistema de expressão heteróloga em levedura utilizando um vetor de expressão induzido por galactose. O principal objetivo deste projeto é caracterizar funcionalmente cada um dos onze mutantes ainda não caracterizados, determinando quais os triptofanos são essenciais para a manutenção da atividade enzimática e relacionando alterações da função da enzima com sua estrutura. Para isto serão determinados a velocidade de hidrólise da enzima mutante e sua dependência de cálcio, os níveis de fosforilação da enzima pela reação da proteína com 32P-gama-ATP, na presença de cálcio, e com 32Pi e EGTA na ausência de cálcio, e a sensibilidade à tapsigargina, um inibidor específico da Ca2+-ATPase do retículo sarco(endo)plasmático. Passos intermediários do ciclo catalítico serão analisados através da parada do ciclo por desnaturação ácida em tempos determinados. Espera-se desta forma contribuir para uma caracterização molecular do mecanismo acoplado de catálise e transporte na Ca2+-ATPase. (AU)