Explorando a seletividade por íons metálicos no sitio ativo da enzima superóxido dismutase (SOD) usando mutagênese sitio dirigida

Autor(es)

Emérita Mendoza Rengifo

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Carlos.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos (IFSC/BT)
• Data de defesa: 2016-09-28

Membros da banca

Richard Charles Garratt; Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo; Marcos Roberto de Mattos Fontes

• Orientador: Richard Charles Garratt

Resumo

Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å e 1.6 Å respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases. (AU)

• Processo FAPESP: 14/01855-2 - Explorando a seletividade por íons metálicos no sítio ativo da enzima Superóxido Dismutase (SOD) usando mutagênese sítio dirigida
• Beneficiário: Emérita Mendoza Rengifo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado