Analise do padrão de metilação da região promotora do gene humano PAX9 (-947 - +251) e analise in vitro da sua atividade transcricional

Autor(es)

Cristiane Pereira Borges Saito

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Piracicaba, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Odontologia de Piracicaba
• Data de defesa: 2009-02-18

Membros da banca

Sergio Roberto Peres Line; Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga; Helena Javiel Alves; Ana Paula de Souza; Lília Freire Rodrigues D'Souza Li

• Orientador: Sergio Roberto Peres Line

Resumo

O gene PAX9 é um regulador chave durante o processo de desenvolvimento dentário e, particularmente em humanos, mutações neste gene estão associadas a fenótipos peculiares como agenesias dentárias. O objetivo deste estudo foi descobrir novas coordenadas acerca da atividade transcricional do promotor desse gene e de um possível padrão de metilação. Quanto ao estudo da metilação, foram avaliadas amostras de DNA genômico extraído da papila dentária de embriões humanos através de enzimas de restrição sensíveis à metilação e através da amplificação por Reação da Polimerase em Cadeia-PCR com oligos específicos. A extração de DNA de amostras incluídas em parafina foi padronizada no laboratório de Morfologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, FOP-UNICAMP. Amostras de DNA extraídas de saliva humana foram usadas como controle. Para os ensaios de transcrição, foram amplificados através de ensaios com a transcriptase reversa, transcritos do gene Pax9 de Células Embrionárias de Rato, bem como de Células Odontoblastóides de Camundongo- MDPC-23 (Mouse Odontoblast Cell-like-23). Esses transcritos foram quantificados através de PCR semi-quantitativa. A região promotora do gene PAX9 humano íntegra (-947 - +251) e deletada (-485 - +22), recombinada com o vetor de expressão pGL3Basic, contendo o gene repórter luciferase após a região promotora, foi transfectada em cultura de Células Embrionárias de Rato. Todas as placas de cultura foram submetidas à ação de duas drogas: Ácido Retinóico (AR) e Dexametasona (Dex). Após a lise das células, os níveis relativos de expressão da proteína luciferase foram analisados, utilizando o kit Dual-Glo Luciferase (Promega), em um luminômetro. Os resultados mostram que: (1) O gene PAX9 encontra-se metilado in vitro; (2) O AR inibiu a síntese de RNA mensageiro transcrito pelas Células Embrionárias Rato. O promotor do gene humano PAX9 clivado nos sítios -485 e +22 e que não continha 507pb não foi afetado pelos receptores do AR. O Promotor PAX9 íntegro foi ativado na presença do AR na maior concentração da droga ; (3) A Dex estimulou a transcrição do gene Pax9 no grupo de células MDPC-23 e influenciou positivamente ambas as versões do promotor do gene PAX9 com as concentrações: 0.1µM e 1nM. Esses resultados demonstraram que os receptores dos hormônios esteróides AR e Dex podem se ligar diretamente a sequências do gene Pax9 em ratos e camundongos e que a região contendo 507pb retirada do promotor do gene PAX9 humano pode conter sítios de ligação para receptores do AR. Além disso, o sítio de metilação encontrado na região promotora do gene PAX9 humano resultou em novas perspectivas acerca do seu padrão de funcionamento em células normais. (AU)

• Processo FAPESP: 04/13983-3 - Analise in vitro da atividade transcricional da regiao promotora do gene pax9 e analise do seu padrao de metilacao.
• Beneficiário: Cristiane Pereira Borges Saito
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado