Isolamento, purificação parcial e caracterização bioquimica da aspartato quinase e homoserina desidrogenase de sementes de sorgo

Autor(es)

Renato Rodrigues Ferreira

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2004-08-13

Membros da banca

Ricardo Antunes Azevedo; Ladaslav Sodek; Jose Ronaldo Magalhaes; Paulo Arruda

• Orientador: Ricardo Antunes Azevedo

Resumo

Sementes de cereais não são boas fontes de aminoácidos essenciais, particularmente lisina e treonina, sintetizados a partir da via metabólica do ácido aspártico. Embora muitas enzimas desta via tenham sido estudadas em várias espécies de plantas superiores, o metabolismo de lisina e treonina ainda é totalmente desconhecido em sorgo. Neste trabalho, foram estudadas duas enzimas, aspartato quinase (AK) e homoserina desidrogenase (HSDH). Condições ótimas de ensaio foram estabeleci das para a determinação das atividades de AK e HSDH. Os maiores níveis de atividade foram observados em sementes imaturas de sorgo, utilizando-se para ambos ensaios 50 _L de amostra e um período de incubação de 10 à 30 min, dependendo da enzima a ser avaliada e da concentração de proteínas da extrato. Particularmente para HSDH, o co-fator mais efetivo para determinação de atividade foi o NADP. Precipitação com sulfato de amônia, cromatografia de troca aniônica e cromatografia de filtração em gel foram os métodos de separação de proteínas utilizados para purificar e identificar as isoenzimas de AK e HSDH de sementes de sorgo. Dois picos de atividade de AK foram eluídos a partir de coluna de troca aniônica (DEAE-Sephacel) com 183 e 262 mmol.L-1 KCl. Os dois picos foram fortemente inibidos por lisina. Com relação à HSDH, dois picos sobrepostos foram eluídos com 145 e 183 mmol.rl KCI, sendo o primeiro pico resistente à inibição por treonina e o segundo sensível à inibição por este aminoácido. Entretanto, através de coluna cromatográfica de filtração em gel (Sephacryl S-200) foi observado um pico de atividade de AK co-eluído juntamente com o pico de HSDH, ambos sensíveis à inibição por treonina, sugerindo a presença de uma isoenzima bifuncional AK-HSDH em sorgo e a massa molecular dessa isoenzima foi estimada em 164 kDa. AAK foi purificada cerca de 30 vezes pelos métodos utilizados. As atividades de AK e HSDH foram estudas na presença de lisina, treonina, metionina, valina, cálcio, EOTA, calmodulina, SAM, AEC e concentrações crescentes de KCl. A AK foi inibida por treonina e lisina, confirmando a existência de duas isoenzimas, uma sensível à inibição por treonina e outra à inibição por lisina, sendo esta última predominante em sementes de sorgo. Metionina, SAM + lisina e AEC, também inibiram a atividade de AK, entretanto, KCI e cálcio também não promoveram alterações na atividade desta enzima, confirmando que a AK de sorgo não é regulada por cálcio. HSDH foi inibida por treonina indicando a existência de uma HSDH sensível à treonina, porém, a maior parte da atividade não foi inibida por treonina, confirmando a existência de uma segunda HSDH quantitativamente predominante, resistente à inibição por treonina. Valina e SAM + treonina também inibiram a atividade de HSDH enquanto que KCI e cálcio não promoveram nenhuma alteração na atividade da enzima. Com relação às proteínas de reserva de sorgo presentes nas sementes do híbrido comercial MASSA 03, foi observada alta concentração de glutelinas e baixa concentração de kafirinas, equivalentes às concentrações encontradas nos mutantes alta lisina. Semelhantemente, em relação aos aminoácidos solúveis, o sorgo MASSA 03, também apresentou concentrações compatíveis às dos genótipos mutantes alta lisina, sugerindo que este híbrido comercial também apresenta característica de alta lisina. Entretanto, para programas de melhoramento, o genótipo de sorgo mais viável seria o mutante IS 16227, devido a seu alto desempenho no que diz respeito às proteínas de reserva e aminoácidos solúveis (AU)

• Processo FAPESP: 00/05960-2 - Isolamento, purificacao e caracterizacao bioquimica e genetica de enzimas da via de biossintese de lisina em sorgo (sorghum ssp).
• Beneficiário: Renato Rodrigues Ferreira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado