Células mesenquimais estromais multipotentes derivadas do tecido adiposo e fração proteica do látex natural (Hevea brasiliensis) associados à scaffolds de policaprolactona e grafeno na osteogênese experimental

Autor(es)

Guilherme Ferreira Caetano

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2017-03-20

Membros da banca

Marco Andrey Cipriani Frade; Paulo Jorge da Silva Bártolo; Celso Herminio Ferraz Picado; Maria Carolina de Oliveira Rodrigues; Adalberto Luiz Rosa

• Orientador: Marco Andrey Cipriani Frade

Resumo

Defeitos ósseos assumem importância na crescente prevalência de condições crônicas de saúde, agravando-se conforme o envelhecimento da população. O tratamento convencional baseia-se no transplante autólogo e abordagens extremamente invasivas. Uma proposta promissora é a obtenção de tecidos saudáveis em laboratórios utilizando suportes tridimensionais porosos (scaffolds) que atuarão como arcabouço para o crescimento e diferenciação de células tronco mesenquimais (CTMs) podendo ser otimizados para proporcionar adequada vascularização, uma importante característica na regeneração óssea. CTMs apresentam potencial de diferenciação, imunoregulação e angiogênese. O pico proteico F1 do soro do látex da seringueira Hevea brasiliensis apresenta importante atividade angiogênica e cicatrizante. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de scaffolds de policaprolactona (PCL) colonizados com CTMs na osteogênese experimental in vitro e in vivo (xenotransplante), a segurança e a influência do pico F1 do látex em cultura de CTMs aplicadas no scaffold de PCL e PCL reforçado com diferentes concentrações de grafeno (PCL/grafeno) na proliferação e diferenciação osteogênica. Para isso, as CTMs foram isoladas do tecido adiposo humano (ADSCs), caracterizadas por imunofenotipagem e diferenciação in vitro. Scaffolds de PCL, produzidos por técnica de manufatura aditiva, foram avaliados quanto ao potencial de adesão/viabilidade celular (ensaio MTT), diferenciação osteogênica (vermelho de alizarina) e potencial in vivo de osteointegração e osteoindução em defeito crítico de calvária avaliados por histologia e imunoistoquímica. O pico F1 do látex, em diferentes concentrações, foi avaliado em cultura de ADSCs e fibroblastos 3T3 quanto a citotoxicidade (MTT), potencial proliferativo (timidina-tritiada), migratório (scratch assay) e indução osteogênica (fosfatase alcalina). Scaffolds de PCL foram reforçados com grafeno (PCL/grafeno), revestidos com pico F1 (adsorção), avaliados quanto a viabilidade/proliferação celular (Alamar blue) e diferenciação osteogênica (fosfatase alcalina e vermelho de alizarina). A imunofenotipagem das ADSCs demonstrou baixa percentagem para marcadores negativos, alta para os positivos e diferenciação in vitro, comprovando o sucesso do isolamento e manutenção das ADSCs. O scaffold de PCL apresentou não-toxicidade e diferenciação osteogênica induzida pelo meio de cultura. Scaffolds de PCL, pré-colonizado e não colonizado com ADSCs, foram implantados em defeito crítico de calvária de ratos. O grupo que recebeu scaffolds com ADSCs humanas proporcionou melhor formação óssea no animal, com participação direta e indireta das ADSCs neste processo. Nos ensaios in vitro com o pico F1 (cultura 2D), observou-se estímulo proliferativo para as concentrações de 0.00001% e 0.0001%, além de maior percentagem de migração celular para as concentrações de 0.001%, 0.0001% e 0.00001%, diferentes do controle. Os scaffolds de PCL/grafeno demonstraram estimulo proliferativo quando colonizados por ADSCs e este estímulo foi ainda maior em scaffolds revestidos com F1, principalmente na concentração de 0.75% de grafeno. Embora o pico F1 não tenha potencializado a diferenciação osteogênico em cultura 2D, este estímulo foi observado em scaffolds revestidos com F1 com superior atividade da fosfatase alcalina. Este trabalho demonstrou sucesso no emprego de ADSCs humanas e scaffolds in vitro e in vivo (transplante xenogênico) para regeneração óssea, além de apresentar dois promissores produtos para engenharia tecidual como os scaffolds com reforço de grafeno em baixas concentrações e o pico proteico F1 na proliferação e diferenciação celular. (AU)

• Processo FAPESP: 13/09055-2 - Osteodiferenciação das células-tronco mesenquimais humanas associadas às proteínas do látex natural da seringueira Hevea brasiliensis sobre scaffold de policaprolactona e ácido polilático (PCL/PLA) para xenoenxertia óssea
• Beneficiário: Guilherme Ferreira Caetano
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado