Emprego de estratégias ômicas na avaliação de plantas de soja transgênica e não-transgênica após cultivo com nanopartículas de prata

Autor(es)

Rodrigo Moretto Galazzi

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Química
• Data de defesa: 2017-09-19

Membros da banca

Marco Aurelio Zezzi Arruda; Márcia Andréia Mesquita Silva da Veiga; Fernando Barbosa Júnior; Ana Valéria Colnaghi Simionato; Carlos Henrique Inacio Ramos

• Orientador: Marco Aurelio Zezzi Arruda

Resumo

Inicialmente, todo um estudo acerca da caracterização e quantificação das nanopartículas de prata (AgNP) foi realizado a fim de se avaliar a concentração de prata (Ag) tanto nas AgNP após a síntese, quanto nas suas frações (AgNP-res e Ag-sob). Com esta abordagem, observou-se que aproximadamente 50% da Ag está na forma de nanopartículas (NPs) na solução de AgNP após a síntese, enquanto os outros 50% da Ag está na forma livre iônica. Tais resultados sugerem que, para estudos sobre a aplicação das AgNPs, é necessária a purificação das mesmas via centrifugação e remoção do sobrenadante (Ag-sob), para que apenas a fração AgNP-res, que contém as NPs, seja empregada. Se essa estratégia não for considerada e a solução após a síntese for diretamente utilizada, possivelmente, os efeitos observados em um estudo serão sinérgicos devido à presença das NPs e da Ag livre na solução após a síntese. Após a avaliação das AgNP a serem empregadas neste estudo, foi realizado um cultivo-teste com uma concentração final de 250 mg kg-1 de Ag no substrato. Nestas condições, ambas as plantas não-transgênicas e transgênicas não sobreviveram ao cultivo com o nitrato de Ag (AgNO3), indicando que as plantas interagem de maneira distinta com as diferentes formas de Ag. Por isso, todos os demais cultivos foram realizados com uma concentração final de 50 mg kg-1 de Ag no substrato. Então, um estudo proteômico por 2-D DIGE foi realizado e diversos spots diferenciais foram encontrados entre as plantas de soja NT e T dos grupos controle e as plantas cultivadas com as AgNP e AgNO3. As plantas de soja NT e T apresentaram um comportamento distinto, em termos de spots diferenciais, uma vez que as plantas NT foram mais afetadas pelo cultivo com o AgNO3, enquanto que as plantas T foram mais sensíveis ao tratamento com as AgNPs, inclusive com um incremento significativo (teste de Tukey - p < 0,05) na quantidade total de proteínas nas folhas de soja. Após os resultados obtidos pela técnica de 2-D DIGE, os estudos proteômicos foram finalizados com a identificação, por espectrometria de massas, daquelas proteínas presentes nos spots diferenciais entre os grupos controle e os cultivados com as AgNP e AgNO3. De maneira geral, independente da forma de Ag empregada no cultivo, ambas as variedades de soja, NT e T, estão sob condição de estresse, uma vez que algumas proteínas relacionadas à tal condição foram identificadas, dentre elas a ribulose. Além da ribulose, espécies como a superóxido dismutase, ATP synthase, triosephosphate isomerase, entre outras, foram identificadas dentre os grupos de soja NT e T tratadas, sugerindo que os cultivos com AgNO3 e AgNP, possivelmente, resultaram em uma condição de estresse oxidativo. Adicionalmente, foi realizado um estudo enzimático com a finalidade de ampliar o entendimento do estresse oxidativo causado pelos cultivos com AgNO3 e AgNP observado nos estudos proteômicos. Enzimas como a catalase (CAT) e a superóxido dismutase (SOD), bem como o conteúdo de H2O2 e malondialdeído (MDA) foram avaliados, confirmando que as plantas de soja NT e T cultivadas com as AgNP e AgNO3 estão sob condição de estresse. Todos os resultados obtidos por meio de uma abordagem proteômica e avaliação enzimática sugerem que, de fato, a resposta de uma planta, em termos de ROS, conteúdo e atividade das enzimas antioxidantes, sob condições de estresse oxidativo, é dependente de vários fatores, dentre eles a espécie de planta estudada (no nosso caso, da variedade) e do tipo de metal/metalóide ou NPs empregados durante o cultivo. Com relação à absorção e assimilação de Ag, de maneira geral, as plantas de soja T translocaram uma maior quantidade de Ag em comparação com a soja NT. Considerando os diferentes tratamentos, independente da variedade de soja, o cultivo com AgNP resultou em uma maior taxa de translocação. Considerando o estudo ionômico, diferenças significativas (p ? 0,05) em termos de macro e micronutrientes foram encontradas em todos os compartimentos, principalmente nas raízes. Sendo assim, a presença de Ag, elemento não essencial para a bioquímica das plantas, em suas distintas formas (AgNP e AgNO3) interfere na absorção de alguns nutrientes. Tal fato pode estar relacionado com condições de estresse e consequente formação de clorose nas folhas das plantas, como observado em nosso estudo. Adicionalmente, foi observada a formação de necrose na parte basal do caule das plantas NT e T expostas às AgNP ou AgNO3. Por fim, o emprego de tampões extratores brandos e estratégias hifenadas baseadas em cromatografia líquida acoplada a ambas as técnicas ICP-MS e ESI-Orbitrap foram consideradas na avaliação de complexos metálicos que possam estar alterados nas folhas de soja NT e T devido aos cultivos com AgNP ou AgNO3. Após a obtenção de perfis de SEC-ICP-MS, diferenças em termos de intensidade foram observadas para Mn, Fe, Zn e Cu entre os grupos controle e tratados. Então, das quatro frações encontradas em SEC-ICP-MS, a fração três (F3) foi considerada e analisada por HILIC-ICP-MS em que perfis para Fe, Zn e Cu, previamente monitorados por SEC-ICP-MS, foram também obtidos. Então, a mesma fração F3 foi analisada por HILIC-ESI-Orbitrap e alguns íons com padrões isotópicos para Cu e Zn foram encontrados. Tais íons foram selecionados para futuros experimentos de fragmentação por HILIC-ESI-Orbitrap no modo tandem. Com tais resultados, espera-se identificar as espécies metálicas e, consequentemente, as possíveis vias que possam estar alteradas nas plantas de soja NT e T devido aos cultivos com AgNP e AgNO3 (AU)

• Processo FAPESP: 13/15646-3 - Avaliação de plantas de soja transgênica e não-transgênica cultivadas em solo tratado com nanopartículas de prata.
• Beneficiário: Rodrigo Moretto Galazzi
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado