Avaliação da expressão de genes candidatos em sistema de RNA interferente (RNAi) em Diaphorina citri (Kuwayama) (Hemiptera: Liviidae), vetor do huanglongbing do citros

Autor(es)

Diogo Manzano Galdeano

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2016-08-30

Membros da banca

Marcos Antonio Machado; Henrique Marques Souza; Katlin Brauer Massirer; Ricardo Harakava; Tiago Campos Pereira

• Orientador: Marcos Antonio Machado

Resumo

O psilídeo Diaphorina citri (Kuwayama) tornou-se nos últimos anos um dos mais importantes vetores na cultura de citros, em função dos crescentes prejuízos causados às plantas pela transmissão das bactérias Candidatus Liberibacter americanus e Candidatus Liberibacter asiaticus, agentes causais do huanglongbing (HLB) dos citros. O manejo do HLB é baseado no uso de mudas sadias, erradicação de plantas infectadas e pelo controle químico do vetor. No entanto, o uso contínuo e intenso de inseticidas é problemático, não só pelos custos financeiros, como também pelos problemas ambientais que o uso excessivo acarreta. Para reduzir os altos custos no desenvolvimento de novos inseticidas e tornar o controle mais eficiente e específico, o silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) é uma das promessas de novas tecnologias utilizadas no controle de pragas e vetores. Assim, os objetivos deste trabalho foram buscar genes candidatos a serem silenciados, estabelecer sistemas de fornecimento de moléculas de dupla fita de RNA (dsRNAs), avaliar a mortalidade e expressão dos genes candidatos a silenciamento de D. citri. Para isso, foi utilizado um sistema de alimentação in vitro composto por diferentes concentrações de sacarose para avaliar a sobrevivência de D. citri nos estágios de ninfa e adultos durante cinco dias. Foi realizada a busca de 16 genes candidatos no transcriptoma e genoma de D. citri. Depois da confirmação das sequências, os genes inhibitor of apoptosis, trehalase, cathepsin D, cathepsin L, chitin synthase, Na+/K+ ATPase subunit-A e ATP synthase subunit-D like mitochondrial foram selecionados para serem transcritos in vitro e três diferentes concentrações de dsRNAs (200, 500 e 1000 ng.?L-1) de cada gene foram incorporadas em dieta artificial para insetos adultos. Também foi elaborado um sistema de fornecimento de dsRNAs de inhibitor of apoptosis, cathepsin D e chitin synthase via ramos de Murraya spp. para avaliar os efeitos de RNAi em ninfas. Nos ensaios de ingestão de dsRNAs via dieta artificial e ramos de murta foram avaliados a taxa de mortalidade e expressão gênica dos insetos, e também, a estabilidade dos dsRNAs. As concentrações 15 e 30% de sacarose no sistema de alimentação in vitro foram as que apresentaram maiores taxas de sobrevivência de D. citri adultas das populações estabelecidas no Centro de Citricultura `Sylvio Moreira¿/IAC e na Universidade da Califórnia-Davis, respectivamente. Após cinco dias, as taxas de mortalidade nos testes de fornecimento de dsRNAs dos genes alvos de D. citri em dieta artificial variaram entre 21-48%, 28-51% e 37-63%, nas concentrações 200, 500 e 1000 ng.?L-1, respectivamente. As taxas de sobrevivência de ninfas no sistema de fornecimento de dsRNAs de inhibitor of apoptosis, cathepsin D e chitin synthase via planta foram de 40, 71 e 50%, respectivamente. As moléculas de dsRNAs foram estáveis nos sistemas de fornecimento avaliados. Além disso, reduções nos níveis de expressão dos genes alvo de D. citri nos ensaios de RNAi foram confirmadas por PCR em tempo real. Estes dados sugerem métodos de fornecimento de dsRNAs, dieta artificial e ramos de murta, são ferramentas úteis para estudos de função gênica e possível controle de D. citri (AU)

• Processo FAPESP: 13/02138-0 - Avaliação de expressão de genes candidatos em sistema de RNA interferente (RNAi) em Diaphorina citri (Kuwayama) (Hemiptera: Psyllidae), vetor do Huanglongbing dos citros.
• Beneficiário: Diogo Manzano Galdeano
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado