Desenvolvimento e avaliação in silico de uma plataforma de expressão baseada em E. coli para a produção de beta-glicosidase recombinante.

Autor(es)

Rafael da Gama Ferreira

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Escola Politécnica (EP/BC)
• Data de defesa: 2019-04-08

Membros da banca

Adriano Rodrigues Azzoni; Thiago Olitta Basso; André Bernardo; Viviane Maimoni Gonçalves

• Orientador: Adriano Rodrigues Azzoni

Resumo

A conversão enzimática de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis é uma via promissora para a produção de combustíveis e produtos químicos renováveis. No entanto, o custo das enzimas fúngicas usualmente empregadas nesse processo permanece um gargalo significativo para a fabricação de produtos de baixo valor agregado a partir de biomassa. Uma possível estratégia para aumentar o rendimento da hidrólise e, assim, reduzir seu custo, seria suplementar as enzimas fúngicas com suas atividades enzimáticas deficientes, tais como a enzima Beta-glicosidase. Para produzir tais enzimas a um baixo custo, a bactéria Escherichia coli é uma forte candidata, dada a sua capacidade de crescer rapidamente em meios simples e baratos e de alcançar altos níveis de produtividade. No entanto, na literatura quase não há análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado utilizando E. coli e, de forma mais geral, há muito poucas análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado publicadas, com exceção da produção de celulases por Trichoderma reesei. Em particular, a aplicação biotecnológica de plataformas recombinantes baseadas em E. coli dotadas de sistemas toxina-antitoxina para garantir a estabilidade plasmidial segue em larga medida inexplorada, e seu impacto econômico, desconhecido. Assim, este trabalho apresenta uma análise técnico-econômica abrangente da produção industrial de uma enzima de baixo custo (Beta-glicosidase) usando E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, uma cepa de BL21 (DE3) modificada que possui um sistema toxina-antitoxina para manutenção plasmidial. Além disso, este estudo descreve a clonagem e expressão de uma Beta-glicosidase em E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, assim como o desenvolvimento de um novo método de produção de inóculo que tira proveito das peculiaridades da linhagem SE1, baseado em reciclar repetidamente uma fração das células do inóculo. Os resultados da análise técnico-econômica apontam para um custo de produção da enzima de 316 US$/kg no cenário-base, valor consideravelmente superior àqueles relatados na literatura para os coquetéis fúngicos. Os custos de overhead da planta, que estão fortemente associados ao custo de aquisição dos equipamentos, são responsáveis por aproximadamente metade do custo total, enquanto o custo de matérias-primas, especialmente IPTG e glicose, e o custo de consumíveis são bastante significativos. Porém, a simulação de múltiplos cenários e medidas de otimização sugerem que o custo da enzima pode ser substancialmente reduzido em muitas frentes, tais como: a substituição da fonte de carbono por alternativas mais baratas; a redução da quantidade de IPTG usado para indução; a utilização de cepas capazes de produzir a enzima extracelularmente; ou a eliminação das etapas de concentração e estabilização da enzima, em caso de utilização da enzima in situ. O desenvolvimento de cepas de E. coli capazes de atingir altas produtividades volumétricas de rEnzima também pode reduzir significativamente o seu custo, chegando a US$ 135/kg no cenário de maior produtividade. Com base nos resultados experimentais com a linhagem E. coli SE1, uma estratégia de reciclagem de inóculo que evita a necessidade de um extenso trem de inoculação também foi simulada, gerando significativa diminuição do custo da enzima. Por fim, a combinação de múltiplas melhorias no processo poderia levar a um custo de enzima em torno de 20 US$/kg de proteína, valor que se aproxima do custo das celulases fúngicas e que demonstra o grande potencial biotecnológico de plataformas de expressão baseadas em E. coli recombinante. (AU)

• Processo FAPESP: 14/13974-6 - Desenvolvimento e avaliação in silico de uma plataforma de expressão baseada em E. coli para a produção de enzimas envolvidas na degradação de biomassa lignocelulósica
• Beneficiário: Rafael da Gama Ferreira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto