Expressão, purificação, caracterização conformacional e funcional da HSPH1, uma co-chaperona HSP110 humana, com ênfase em seu papel em sistemas de desagregação de proteínas

Autor(es)

Gabriela de Mello Gandelini

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Química
• Data de defesa: 2018-04-12

Membros da banca

Carlos Henrique Inacio Ramos; Taicia Pacheco Fill; Julio Cesar Borges

• Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos

Resumo

O enovelamento incorreto de proteínas pode ocasionar diversas doenças e até mesmo o envelhecimento. Ele pode levar à perda de função das proteínas ou acarretar na formação de agregados proteicos amiloidogênicos, os quais estão envolvidos com diversas doenças. Para se proteger desses agregados, diversos organismos expressam chaperonas moleculares da família Hsp100 (ClpB em bactéria, Hsp104 em levedura e Hsp101 em plantas, por exemplo), que são capazes de desagregar outras proteínas levando à reativação das mesmas. Surpreendentemente, metazoários não possuem um gene para a família da Hsp100. Contudo, estudos recentes mostraram que a co-chaperona Hsp110 tem função desagregase. Dessa forma, o objetivo desta dissertação é caracterizar a HSPH1, uma co-chaperona Hsp110 humana, através da expressão, purificação e caracterização da sua relação estrutura e função. O gene hsph1 clonado no vetor pPROEX-Htb foi expresso na forma solúvel em Escherichia coli (E. coli) BL21(DE3) e a proteína recombinante foi purificada em duas etapas cromatográficas, afinidade e exclusão por tamanho. As análises de espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD) determinaram que a HSPH1 foi expressa e purificada enovelada e estável, com estrutura secundária predominante do tipo hélice ?, conservada até 48 ºC e na presença de ureia 3 mol/L. Além disso, a análise da emissão de fluorescência indicou que pelo menos um dos resíduos de triptofano se encontra parcialmente localizado no interior da proteína enovelada. As propriedades hidrodinâmicas (massa molecular, coeficiente de difusão e raio de Stokes), obtidas através das técnicas de cromatografia de gel filtração analítica (GFA), cromatografia de exclusão por tamanho acoplada ao detector multiângulo (SEC-MALS) e espalhamento de luz dinâmica (DLS), mostraram que a HSPH1 se comportou como um monômero com conformação alongada. Finalmente, os experimentos funcionais mostraram que a proteína possui atividade chaperona seletiva, sendo capaz de proteger de maneira diferente proteínas-cliente contra a agregação. Os resultados obtidos têm potencial para acrescentar significativamente ao conhecimento sobre a homeostase proteica na célula, podendo gerar insumos que tenham aplicação médica e biotecnológica (AU)

• Processo FAPESP: 16/04246-2 - Clonagem, expressão, purificação, caracterização biofísica e funcional de membros da família da co-chaperona Hsp110 humana com ênfase em seu papel em sistemas de desagregação de proteínas
• Beneficiário: Gabriela de Mello Gandelini
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado