Genome mining e estratégias de clonagem para caracterização de vias biossintéticas de PKS e NRPS em Streptomyces sp. CBMAI 2042

Autor(es)

Renata Sigrist

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Química
• Data de defesa: 2019-07-30

Membros da banca

Luciana Gonzaga de Oliveira; Daniela Barretto Barbosa Trivella; Mônica Tallarico Pupo; Paulo Cezar Vieira; Anita Jocelyne Marsaioli

• Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira

Resumo

Actinobacteria é um filo de bactérias Gram-positivas que habitam ambientes terrestres ou aquáticos e são de grande relevância para a pesquisa acadêmica e a indústria farmacêutica devido ao grande potencial de biossintetizar diferentes classes de produtos naturais. Os policetídeos e os peptídeos não ribossomais destacam-se por combinar alta complexidade estrutural a uma ampla gama de atividades terapêuticas, tais como antibiótica, antitumoral e imonussupressora. Os genes biossintéticos que codificam para enzimas produtoras desses compostos podem ser mapeados pelo sequenciamento e genome mining de diferentes linhagens de Streptomyces, de modo a auxiliar e agilizar a busca por novos e importantes alvos terapêuticos. O microrganismo endofítico Streptomyces sp. CBMAI 2042, isolado de Citrus sinensis, foi sequenciado e a análise in silico do genoma permitiu identificar um cluster de genes órfão composto por uma PKS do tipo 1, trans-AT PKS e NRPS. O estudo aqui apresentado visou a clonagem desse cluster de genes biossintético através de bibliotecas genômicas em vetores do tipo BAC e ESAC (empresa Bio S&T) e de técnicas de recombinação de DNA, como l- RED, Gibson Assembly® e TAR-cloning, para posterior expressão em organismo heterólogo S. coelicolor. O cluster órfão obtido via TAR-cloning e expresso em S. coelicolor M1146 foi associado a produção de alpiniamida. A deleção do domínio de adenilação confirmou a correlação da via de biossíntese com a molécula isolada e caracterizada. Experimentos com precursores marcados embasaram a proposta de biossíntese dessa via mista trans-AT PKS/NRPS. Adicionalmente, o cluster de genes codificando para biossíntese da valinomicina, composto já descrito na literatura e produzido majoritariamente pela linhagem selvagem em diferentes cultivos, foi identificado no genoma e foi também selecionado para triagem de clones na biblioteca genômica. A clonagem e expressão heteróloga levou ao incremento de três vezes a produção do metabólito. Além disso, a associação da estratégia de molecular networking, levou a identificação de pelo menos seis análogos estruturais, entre eles a montanastatina, sendo pela primeira vez associados a mesma via de biossíntese (AU)

• Processo FAPESP: 15/01013-4 - Identificação e caracterização de uma t1PKS-transAT PKS-NRPS em Streptomyces sp. via genome mining
• Beneficiário: Renata Sigrist
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto