Purificação e caracterização das β-glicosidases digestivas de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)

Autor(es)

Sandro Roberto Marana

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 1999-04-05

Membros da banca

Clélia Ferreira Terra; Pedro Soares de Araújo; Ângelo Geraldo Gambarini; Osvaldo Marinotti; Helena Bonciani Nader

• Orientador: Clelia Ferreira Terra

Resumo

Foram purificadas através de uma combinação de cromatografias as duas β- glicosidases digestivas (Mr 47.000 e 50.000 - denominadas β47 e β50, respectivamente) encontradas na larva de S. frugiperda. Experimentos de competição entre substratos e modificação química mostraram que a β47 possui dois sítios ativos. Um desses sítios denominado aril&$946;glicosidase apresenta um subsítio -1 que liga galactose mais eficientemente do enquanto ,que o subsítio +1 prefere pequenos grupos hidrofóbicos cíclicos. O segundo sítio, denominado celobiase, possui um subsítio -1 que prefere glicose. Já a região de ligação do aglicone apresenta 4 subsítios, que ligam glicose com afinidade decrescente à medida que afastam-se do ponto de clivagem do substrato. O cDNA que codifica a β50 foi clonado e sequenciado. Alinhamentos de sequência de aminoácidos, experimentos de competição entre substratos e inibição mostraram que esta enzima possui apenas um sítio ativo. O subsítio -1, cuja especificidade é controlada por uma rede de pontes de hidrogênio, foi estudado comparando-se os parâmetros cinéticos (Kcat e KcaUKm) para a hidrólise de NPβglicosídeos. A região de posicionamento do aglicone, uma fenda hidrofóbica composta de 3 subsítios, foi caracterizada utilizando-se alquil β-glucosídeos e oligocelodextrinas como inibidores. O alinhamento da sequência de aminoácidos da β50 com outras glicosil hidrolases sugeriu quais aminoácidos participariam da ligação do substrato e que o GlU187 (doador de prótons - pKa = 7,5) e o GIU399 (nucleófilo - pKa = 4,5) estão diretamente envolvidos na catálise. Além disso, a Arg97 e a Tyr331 participam indiretamente modulando o pKa do GIU399. r . (AU)

• Processo FAPESP: 94/02436-8 - B-glucosidases e b-galactosidases intestinais de insetos
• Beneficiário: Sandro Roberto Marana
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado