Busca de inibidores do sistema peroxirredoxina 2-Cys típicas de eucariotos: avaliação funcional e estrutural

Autor(es)

Ana Laura Pires de Oliveira

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Vicente. 2021-09-16.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências. São Vicente
• Data de defesa: 2021-08-20
• Orientador: Marcos Antonio de Oliveira

Resumo

Em infecções causadas por fungos patogênicos, o estresse oxidativo/nitrosativo promovido por células de defesa do hospedeiro e/ou pela ação de fungicidas, é utilizado para controlar a progressão do patógeno. Entretanto, em indivíduos imunocomprometidos, infecções invasivas e linhagens resistentes aos principais fungicidas, como por exemplo, a anfotericina B (AMB), representam um grave problema de saúde pública. A resistência destes patógenos está relacionada com difersos fatores, dentre eles, a presença de enzimas antioxidantes de alta eficiência, capazes de neutralizar os oxidantes produzidos pelo hospedeiro e pela administração de fungicidas. Neste contexto, um grupo de peroxidases denominadas Peroxirredoxinas 2-Cys típicas (Prx 2-Cys típicas) se destacam por decompor uma grande variedade de hidroperóxidos com alta especificidade e eficiência (k = 106 – 108 M-1s-1), estarem distribuídas nos mais diversos ambientes celulares e possuírem uma cisteína altamente reativa denominada cisteína peroxidásica (CP). Apesar das Prx 2-Cys típicas de fungos patogênicos serem um alvo bastante atraente para o combate de infecções fúngicas, nenhum inibidor de Prx 2-Cys típicas foi caracterizado para estes organismos. Por outro lado, já foram descritos inibidores destas enzimas para mamíferos, dentre eles, diterpenóides naturais como a Adenantina (Adn) e o JDA-202, que são capazes de inibir isoformas citosólicas das Prx 2-Cys típicas de humanos (Prx1 e Prx2), levando a remissão de tumores com baixa toxicidade para células sadias. É importante ressaltar que estudos que investigam inibidores de Prx 2-Cys típicas nunca atentaram para uma avaliação comparativa com enzimas de outros organismos. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a Adn é capaz de inibir as isoformas citosólicas Tsa1 e Tsa2 de Saccharomyces cerevisiae, um organismo modelo para estudos bioquímicos e genéticos. Investigações realizadas no âmbito deste trabalho revelaram que Tsa1 apresenta alta identidade com isoformas citosólicas de leveduras patogênicas dos gêneros Candida e Cryptococcus, revelando que esta levedura é um bom modelo para estudo destes micro-organismos. Os objetivos deste trabalho residiram na busca por compostos naturais da biota costeira de São Paulo com atividade inibitória sobre Prx 2-Cys típicas de fungos, utilizando como modelo Tsa1 de S. cerevisiae de forma comparativa com Prx2, a isoforma mais abundante de Prx 2-Cys típicas de humano e na utilização desta levedura para ensaios in vivo do potencial fungicida dos compostos identificados como inibidores de Tsa1, assim como inibidores + fungicidas amplamente utilizados em tratamentos clínicos (ex: AMB). Neste contexo, foram avaliadas as propriedades inibitórias da Adn, assim como de terpenóides ent-caurânos e lactonas sesquiterpenicas da biota brasileira. Nossos resultados revelaram que a Adn, como esperado, é capaz de inibir eficientemente a Prx2 humana e redeterminamos seu IC50 como 2 ± 0.13 μM. Em relação aos compostos naturais, nossos resultados revelaram que os compostos NC-EK2, NC-LS1, NC-LS5, NC-HP1 e NC-ABP1 foram capazes de exercer atividade inibitória sobre as Prx 2-Cys típicas por mecanismos aparentemente distintos. Também demonstramos que NC-LS5 é capaz de execer atividade inibitória sobre o crescimento de células de levedura. Evidências obtidas por SDS-PAGE indicam que NC-LS1 é capaz de impedir a formação de dissulfetos, o que pode ser atribuído aos sistemas carbonilicos ,-insaturados presentes em sua estrutura, capazes de efetuar uma adição de Michael com tióis das enzimas, indicando uma inibição irreversível a exemplo de Adn. Por outro lado, o composto NC-EK2 não possui estes sistemas sugerindo uma inibição do tipo competitiva, entretanto, análises adicionais são necessárias para se chegar a qualquer observação mais conclusiva. Foram realizados procedimentos de docking molecular sobre as estruturas de Tsa1 e Prx2, visando um melhor entendimento das interações moleculares entre os compostos identificados como inibidores. Inicialmente, efetuamos as simulações utilizando Tsa1 e os inibidores Adn e NC-LS1, onde Adn foi utilizada por já existirem dados comparativos de docking utilizando Prx1 de humanos e ambos são capazes de bloquear as cisteínas. Desta forma, para ambos os compostos, se esperaria resultados positivos em regiões próximas as cisteínas. Os resultados obtidos indicam que o posicionamento dos compostos ocorreu integralmente na região do sitio ativo próximo à CP e que as interações para estabilização dos ligantes são majoritarimante de caráter hidrofóbico envolvendo átomos das cadeias laterais dos resíduos Leu41, Phe45, Leu142, Val167, Pro181 e Tyr77 e também das cadeias principais de Phe45, Leu142. A maioria dos resíduos identificados em Tsa1 são equivalentes aos resíduos já relatados na literatura, identificados por docking em Prx1 de humanos, assim como aos resíduos que interagem com um ligante cristalizado juntamente com Tsa1 pelo nosso grupo de pesquisa (PDB: 3SBC), o que gera uma maior confiabilidade dos dados obtidos. De forma geral, os resultados obtidos neste projeto representam a primeira abordagem comparativa da atividade inibitória de compostos naturais sobre 2-Cys Prx típicas humana e de fungo incluindo a identificação de novos compostos da biota costeira brasileira. (AU)

• Processo FAPESP: 19/04054-4 - Busca de inibidores do sistema peroxirredoxina 2-Cys típicas de eucariotos: avaliação funcional e estrutural
• Beneficiário: Ana Laura Pires de Oliveira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado