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Avaliação de moléculas bioativas como inibidores do sistema antioxidante de peroxirredoxinas 2-Cys típicas (AhpC) em bactérias

Processo: 17/06263-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de julho de 2017
Vigência (Término): 30 de junho de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Convênio/Acordo: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Melina Cardoso dos Santos
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IB-CLP). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/07937-8 - Redoxoma, AP.CEPID
Assunto(s):Estresse oxidativo   Antibióticos

Resumo

O aumento da resistência aos antibióticos por microrganismos tem crescido vertiginosamente e especialistas tem alertado quanto à rápida ineficácia dos medicamentos frente a linhagens de bactérias super-resistentes. Trabalhos recentes indicam que a resistência de bactérias aos antibióticos pode estar diretamente relacionada ao estresse oxidativo, pois antibióticos distintos possuem a capacidade convergente de produzir espécies reativas de oxigênio (EROs), que causam danos às macromoléculas, em especial ao DNA, acentuando as taxas de mutação o que pode contribuir para o aparecimento de linhagens super-resistentes. EROs também são produzidas pelo sistema imunológico de hospedeiros para combater patógenos e estudos indicam que a inibição da expressão de enzimas antioxidantes de patógenos é capaz de gerar um aumento intracelular significativo dessas EROs, o que interfere de forma substancial na sobrevivência de patógenos. Recentemente foi demonstrado que uma molécula é capaz de inibir a atividade de peroxidases denominadas peroxirredoxinas (Prx), resultando na mortalidade de células tumorais, mas apresentando baixa toxicidade para células normais. As Prx são capazes de decompor hidroperóxidos utilizando um resíduo de cisteína (CP) que, após decompor o peróxido, é geralmente reduzido pelas enzimas Trx e TrxR. Cabe ressaltar que a alta reatividade de CP é alcançada por interações com os resíduos de Thr/Ser e Arg, absolutamente conservados entre as Prx. Em conjunto, CP, Thr/Ser e Arg, recebem o nome de tríade catalítica (TC). As Prx também estão presentes em bactérias e são denominadas de AhpC, sendo consideradas uma das frentes de defesa fundamentais para a resistência do patógeno ao processo de explosão oxidativa promovida pelo sistema imune do hospedeiro. Entretanto, nestes organismos, a redução de AhpC é efetuada majoritariamente por uma enzima denominada AhpF, embora as Trx e TrxR bacterianas também possam desempenhar esta função. Em projeto anterior, avaliamos os efeitos das substituições de aminoácidos da TC sobre a estrutura e função de Prx. Demonstramos que a substituição de uma treonina (Thr) presente em Prx de eucariotos, por serina (Ser) leva a alterações funcionais e estruturais dessas proteínas. No meu mestrado, demonstramos que o inibidor citado anteriormente possui maior afinidade por enzimas contendo Ser na TC, e que esta substituição existe essencialmente em procariotos, sobretudo em bactérias. Ensaios de citotoxicidade indicaram que esta molécula possui baixa toxicidade para Escherichia coli que possui Thr na TC da AhpC, ao passo que a toxicidade é elevada para aquelas que possuem Ser, como é o caso dos patógenos Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. Entretanto, apesar de esta molécula apresentar grande potencial para utilização como bactericida, estudos adicionais são necessários para uma maior compreensão de sua atividade. Neste projeto, inicialmente iremos e avaliar a inibição da atividade peroxidásica deste composto sobre AhpC de bactérias que possuem Thr como parte da TC e que naturalmente possuem a substituição de Thr®Ser, bem como o efeito da toxicidade deste inibidor sobre as bactérias. Posteriormente, investigaremos a ação desta molécula utilizando as proteínas AhpC e AhpCT44S de E. coli. Avaliaremos in vitro sua capacidade de inibição sobre essas proteínas utilizando dois sistemas redutores envolvidos na redução de AhpC (Trx-TrxR e AhpF) em linhagens de E. coli Dahpc, Dtrxa, DTrxR e Dahpf. Para avaliar se a inibição é dependente da Ser ou Thr na TC, linhagens de E. coli Dahpc serão transformadas com plasmídeos carreando o gene que codifica a enzima selvagem AhpC de E. coli (pPROEX- ahpc) ou a enzima mutante AhpCT44S (pPROEX- ahpct44s). Por fim, serão selecionadas moléculas comerciais e extraídas de plantas do Brasil que apresentem similaridades estruturais e funcionais com o composto em questão e será avaliado o potencial inibitório sobre enzimas AhpC contendo Thr ou Ser. (AU)